反转录酶的主要用途

发布日期:2020/10/18 17:56:53

概述^[1]

反转录酶(reverse transcriptase,也可写成逆转录酶)又称为依赖RNA 的DNA 聚合酶。1970 年Temin 等在致癌RNA 病毒中发现了一种特殊的DNA 聚合酶，该酶以RNA 为模板，以dNTP 为底物，tRNA( 主要是色氨酸tRNA) 为引物，在tRNA 3'-OH 末端上，根据碱基配对的原则，按5'-3'方向合成一条与RNA 模板互补的DNA 单链，这条DNA 单链叫做互补DNA (complementary DNA，CDNA)。

反转录酶（Reverse transcriptase）是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。哺乳类C型病毒的反转录酶和鼠类B型病毒的反转录酶都是一条多肽链。鸟类RNA病毒的反转录酶则由两上亚基结构。真核生物中也都分离出具有不同结构的反转录酶。

主要用途^[2,3]

为了探究人参皂普生物合成途径与功能基因表达量之间的关系，首要的问题是提取完整性好、纯度高的总RNA。由于植物细胞组成成分复杂多样，使得植物组织总RNA的提取难于其他生物材料。成熟的人参组织中含有大量的酚类、糖类，人参组织的研磨过程破坏了酚类物质与多酚氧化酶的平衡分布，酚类极易被氧化成醒，并易与RNA分子发生不可逆结合，产生褐化反应，从而影响RNA的提取，导致RNA的产量、质量较差。本研究比较了7种提取人参根、叶片总RNA的方法，筛选出适合提取人参根、叶片总RNA的提取方法，并用该方法提取出完整性好、纯度高的总RNA。反转录可以检测提取的总RNA质量，反转录酶的不同直接决定反转录效果，本试验比较了3种反转录酶对总RNA的转录情况，筛选出转录效果较好的方法，为人参皂普合成途径中功能基因的克隆与功能研究奠定了一定的理论基础。

不同反转录酶合成DNA的检测:

以PrimeSciript ReverseTransciriptase试剂盒、Reverse Tran-sciriptase M一MLV(RNaseH一)试剂盒、(osoril、trhiGoSciriptReverseTranscription System试剂盒对RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒提取的人参根总RNA进行反转录得到的cDNA为模板，采用PgSSI基因的引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图所示。

经PrimeSciript Reverse Transciriptase试剂盒、Reverse Tran-sciriptase M一MLV ( RNase H一)试剂盒、(;osoril、trhiGoSciript ReverseTranscription System试剂盒对人参根总RNA进行反转录得到cDNA，根据已报道的人参PgSSI基因设计引物: PgSSIF,5'-AAATGGGAAGTTTGGGGGC一3';PgSSI R,5’一(GGGTTCT-CACTGTTTGTTCAG -3';在PgSSI基因的引物下进行的PCR均能得到1条碱基数在1000-2000bp之间的片段，且条带清晰;而经GoSciript，Reverse Transcription System试剂盒反转录的cDNA扩增出的片段亮度明显高于PrimeSciript Reverse Transciriptase试剂盒、Reverse Transcriptase M一MLV ( RNaseH一)试剂盒，而且没有拖带现象，证明其专一性比较强，反转录效率较高，但是3种方法得到的cDNA均可用于后续的分子研究。

人端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，为端粒酶催化亚基，是控制酶活性的关键部分。很多关于端粒酶反转录酶的研究均说明端粒酶的活性、端粒酶反转录酶的水平与动物神经元的生死存亡有着一定的联系，且在细胞永生化及恶性肿瘤的发生和发展中起到了重要的作用。近些年来关于糖尿病的再生替代疗法受到医学研究者们的重视，现已成为学者们关注的焦点。目前治疗糖尿病的方法主要有胰岛移植、胰腺移植以及干细胞移植，其中骨髓间充质干细胞移植引起人们更多的关注。骨髓间充质干细胞是山中胚层发育的早期细胞，具有多向分化潜能，现已被证明可在体外诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞等。此外，已有动物实验证明骨髓间充质干细胞可以恢复糖尿病大鼠的胰岛功能，纠正其高血糖，这一机制可能与促进自体胰腺干细胞再分化有关。目前已有多项研究证实了骨髓源性干细胞在特定条件下可被诱导分化成胰岛素分泌细胞。刘佳等主要观察人端粒酶反转录酶基因修饰的骨髓间充质干细胞对SD大鼠糖尿病的治疗效果。