考马斯亮兰的制备方法

发布日期:2020/10/18 17:56:53

背景及概述^[1]

考马斯亮蓝(coomassiebrilliantblue)一定范围内与蛋白质浓度成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0~1000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

制备^[1-4]

考马斯亮兰应用举例如下：

1）运用考马斯亮兰G250显色剂测定壳聚糖中蛋白含量。方法：蛋白质分子均具有酰胺基团，考马斯亮兰G250染料上的阴离子与蛋白质上的酰胺结合，使溶液变为蓝色，于595nm处测定吸光度可计算出样品中蛋白质的含量。结果：考马斯亮兰G250分光光度法测定壳聚糖样品中蛋白质含量是可行的，相对标准偏差为3.6%～4.9%，回收率为93.2%～108.7%。结论：该法具有简便、快速、灵敏度高、重现性好等特点。

2）将牛奶用考马斯亮兰法测定，其吸光度为A前。同时，将其用1：2的乙醇变性沉淀，过滤后，滤液用相同的考马斯亮兰法测定，吸光度为A后。计算A后/A前作为判断牛奶是否掺假的根据。根据大量测量数据，正常比值应该在9％～12％，高于此数值，即为加入其它含氮物质，可判为掺假。

3）考马斯亮兰G250法(Bradford法)是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。将其用于检测果汁中的蛋白，研究发现，苹果汁中的几种主要成分，如：果糖、葡萄糖、蔗糖和苹果酸等不会对测定造成干扰，其吸收波长不变，标准曲线的线性较好。并对苹果浓缩汁生产中不同工序物料中的蛋白含量进行测定，测定结果的精密度较好，加标回收率在97.76%～103.20%之间。

4）考马斯亮兰G250法测定胃液蛋白质含量。采用改进的Ｂｒａｄｆｏｒｄ法对26例正常人、8例胃癌、24例溃疡及慢性胃炎、4例肠上皮化生以及4例萎缩性胃炎患者胃液进行蛋白质含量测定。结果：G250与胃液蛋白结合后的吸收波长为595nm，反应体系中加入20μl10mol/ＬNａOH后明显提高光吸收值（Ｐ＜0.05），线性范围在0～500μg/ml间，比文献报道的高，胃液蛋白质与G250结合后30min内保持稳定，本法重复性好，回收率达93.7％。结果还提示：胃癌组的胃液蛋白质含量明显高于正常对照组和其它胃疾病组（Ｐ＜0.01或Ｐ＜0.05）。结论：用G250法测定胃液蛋白质含量是一种可靠、简便、快速、灵敏的方法，结果具有一定的临床意义。