大鼠直肠上皮细胞的应用

背景^[1-2]

大鼠直肠上皮细胞分离自无菌大鼠直肠上皮组织，通过胶原酶消化制备而来细胞的纯度在90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。肠上皮细胞是机体内外环境的重要屏障，持续暴露于大量抗原中，也是机体面对病原微生物的道防线。因此，IECs除有吸收、分泌和转运等重要生理功能之外，在粘膜先天性和获得性免疫防御机制中也起着重要作用。

培养条件^[3-5]

1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640：GIBCO，货号21875-091)，90%；优质胎牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。

复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

大鼠直肠上皮细胞复苏操作要点：

1、将培养基在37℃水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。

2、将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37℃的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过zui易受损的温度段（-5~0℃）。注意冻存管管口不能没入水中，避免引起污染。

3、用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散，降低DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次，均转移至离心管内。

4、800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的培养基，吹打制成细胞悬液。

5、将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。

6、第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。

应用^[6]

用于盐酸氯丙嗪促进药物直肠吸收机制研究。

盐酸氯丙嗪（Chlorpromazine Hydrocloride,N,N-二甲基-2-氯-10H-吩噻嗪-10-丙胺盐酸盐）为吩噻嗪类抗精神病药。Fix等报道与静脉注射给药相比,吩噻嗪类药物可显著提高硫酸庆大霉素与头孢噻吩钠的直肠吸收相对生物利用度;本课题组在前期研究中也观察到盐酸氯丙嗪能够较大程度地提高安乃近经兔直肠吸收的速度与程度且具有浓度依赖性。这些结果表明盐酸氯丙嗪有可能是一种新型的药物直肠吸收促进剂,但其促吸收机理仍未见报道。以Caco-2细胞单层模型为药物转运吸收的体外模型,选择脂溶性小（logKow=0.38）且直肠吸收效果欠佳的氨基比林为被促进模型药,通过对盐酸氯丙嗪促吸收作用的具体特征的研究,考察不同浓度盐酸氯丙嗪对Caco-2细胞膜结构与流动性的影响,以及应用免疫荧光法和Western blot法考察Caco-2细胞单层膜中紧密连接蛋白ZO-1分布与表达的变化情况,为阐明盐酸氯丙嗪作为直肠吸收促进剂的可能机理提供依据。

构建了完整性良好的Caco-2细胞单层模型,即Caco-2细胞经21-24天培养,形态学上融合形成连续、完整的致密细胞单层,其AP侧覆盖一层刷状缘微绒毛,此时TEER>200Ω·cm2,荧光黄的Papp<1.0×10-6cm/s,即表明单层膜非常致密且具有良好完整性,可以用于药物转运研究。建立HPLC-MS/MS法作为盐酸氯丙嗪和氨基比林同步定量方法:盐酸氯丙嗪在0.0050.32mg/l范围内具有良好的线性关系,平均回收率为92.1%114.68%,日内与日间相对标准偏差（RSD）均未大于8%;氨基比林在0.0050.32mg/l范围内具有良好的线性关系,平均回收率为97%107.16%,日内与日间相对标准偏差（RSD）均未大于8%,说明本方法专属性强、重现性好、精密度和回收率均较高,可作为转运研究的生物样品测定方法。MTT法以90%以上的Caco-2细胞存活率确定转运试验的药物浓度:盐酸氯丙嗪低、中、高浓度为2.5、10、40mg/l和氨基比林低、高浓度为10、40mg/l。盐酸氯丙嗪与氨基比林按分组设计以不同浓度加至Caco-2细胞单层膜的AP侧,于不同时间在BL侧取样,用HPLC-MS/MS法测定各样品浓度,采用内标法进行定量。

参考文献

[1]Improvement of intestinal absorption of insulin and water-soluble macromolecular compounds by chitosan oligomers in rats[J].Yang Gao,Lin He,Hidemasa Katsumi,Toshiyasu Sakane,Takuya Fujita,Akira Yamamoto.International Journal of Pharmaceutics.2008(1)

[2]The Effect of Simvastatin on Erythrocyte Membrane Fluidity During Oxidative Stress Induced by Cardiopulmonary Bypass:A Randomized Controlled Study[J].Raffaella Coccia,Cristiano Spadaccio,Cesira Foppoli,Marzia Perluigi,Elvio Covino,Mario Lusini,Massimo Chello.Clinical Therapeutics.2007(8)

[3]Loss of the Tight Junction Protein ZO-1 in Dextran Sulfate Sodium Induced Colitis[J].Lisa S.Poritz,Kristian I.Garver,Cecelia Green,Leo Fitzpatrick,Francesca Ruggiero,Walter A.Koltun.Journal of Surgical Research.2007(1)

[4]Quantitative determination of forty-eight antidepressants and antipsychotics in human serum by HPLC tandem mass spectrometry:A multi-level,single-sample approach[J].H.Kirchherr,W.N.Kühn-Velten.Journal of Chromatography B.2006(1)

[5]Absorption enhancement,mechanistic and toxicity studies of medium chain fatty acids,cyclodextrins and bile salts as peroral absorption enhancers[J].Pradeep Sharma,Manthena V.S.Varma,Harmander P.S.Chawla,Ramesh Panchagnula.Il Farmaco.2005(11)

[6]杨丹.盐酸氯丙嗪促进药物直肠吸收机制研究[D].第三军医大学,2009.