核酸酶的应用

概述^[1]

核酸酶是一类能够水解DNA与RNA等核酸分子的酶。根据底物偏好差异，核酸酶分为RNA核酸酶与DNA核酸酶。核酸酶在食品工业中具有广泛应用，用于生产单核苷酸产品，以及去除蛋白，糖等生物制品中的核酸杂质。绝大部分核酸酶为常温核酸酶，在高温容易失活，给生产运输带来了不便，特别是不适合于高温生产工艺。

非特异性核酸内切酶是一类高活性的水解酶，其特点是能非特异性地降解几乎所有形式的核酸。来自粘质沙雷氏菌非特异性核酸内切酶是其中的典型代表，该酶能降解各种形式核酸的核酸内切酶，包括单链，双链，线性和环状DNA和RNA以及基因组DNA，对核酸的序列没有严格要求，并且没有蛋白酶活性。该酶在广泛条件范围具有很高的核酸降解活性，能将核酸完全消化成杂交限度以下的2-5个碱基长度的5’-单磷酸寡核苷酸。

该酶由分子量为30kDa的两个亚基组成，作用的pH范围为6～10，温度0～42℃，酶发挥活性需要1～2mM Mg2+。在离子型及非离子型表面活性剂和1mM PMSF，1mM EDTA，尿素存在下，核酸酶仍具有活性。大于150mM的单价阳离子，大于100mM的磷酸根，大于100mM硫酸铵和大于100mM盐酸胍抑制酶的活性。

核酸酶具有广阔的应用前景，适合从生物制品中去除核酸，其主要应用于以下几个方面：

1、提高产品质量：核酸酶通过降低生物制品，尤其是病毒类产品外源性核酸的含量，减少过敏反应，提高制品安全性；

2、改善重组蛋白工艺：工程细胞裂解后加入核酸酶可降低料液的黏度，缩短处理时间，提高蛋白产量，离心时有利于沉淀和上清液的分离，超滤时有利于各成分的分离，提高柱层析纯化时的有效性；

3、颗粒(病毒、包涵体等)预处理：有助于颗粒的纯化；

4、生物分析样品的处理：在ELISA、柱层析、二维电泳和印迹分析中，通过核酸酶的作用可提高分辨率和回收率。

制备^[2]

热稳定性核酸酶的制备：

步，设计合成嗜热微生物Pyrococcusfuriosus热稳定性核酸酶基因，并插入pET28表达载体，构建热稳定性核酸酶的重组表达质粒。重组嗜热微生物Pyrococcusfuriosus热稳定性核酸酶N端带有来源于pET28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化。

第二步，重组表达嗜热微生物Pyrococcusfuriosus热稳定性核酸酶。将嗜热微生物Pyrococcusfuriosus热稳定性核酸酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到嗜热微生物Pyrococcusfuriosus热稳定性核酸酶重组表达菌株。将表达菌株培养至OD600=0.6，加入0.5mM诱导剂IPTG，在16℃温度下培养12小时，诱导嗜热微生物Pyrococcusfuriosus热稳定性核酸酶表达。

第三步，嗜热微生物Pyrococcusfuriosus热稳定性核酸酶亲和纯化。将步骤二诱导后的大肠杆菌离心收集后，菌体重新悬浮于蛋白裂解液（20mMTris-HCl,pH8.0,300mMNaCl,0.5mMDTT，10vol%甘油）。超声波破碎菌体，加热失活大肠杆菌杂质蛋白，离心收集含有嗜热微生物Pyrococcusfuriosus热稳定性核酸酶的菌体裂解上清液。利用固定化镍离子亲和纯化树脂纯化嗜热微生物Pyrococcusfuriosus热稳定性核酸酶。

第四步，检测嗜热微生物Pyrococcusfuriosus热稳定性核酸酶的酶活性和酶活温度依赖性。利用长度40个核苷酸的DNA与RNA分子作为底物，加入嗜热微生物Pyrococcusfuriosus热稳定性核酸酶，测定热稳定性核酸酶的酶活性温度依赖性。测定结果表明嗜热微生物Pyrococcusfuriosus编码的热稳定性核酸酶在50-70度范围内具有最高的活性，同时该蛋白具有良好的热稳定性。

固定化核酸酶制备：

30g壳聚糖溶解在600mL0.25mol/L的乙酸溶液中，室温下剧烈搅拌4h，粘稠状液体通过三层棉布过滤除去不溶性杂质，然后逐渐滴加1mmol/L NaOH2L，碱性条件下(pH8.0～10.0)使壳聚糖沉淀，混合液在去离子水中透析3d，离心分离使绝大部分的壳聚糖沉淀下来，双蒸水洗脱，真空冷冻干燥，在研钵中将其粉碎成粉末状，备用。

取50ml核酸酶溶液，加入10g处理好的脱乙酰壳聚糖中，磁力搅拌30min，滴加一定浓度的戊二醛溶液60mL，恒温搅拌一定时间，与4℃冰箱中交联12h，最后用相应pH值的缓冲溶液淋洗，抽干，即得固定化核酸酶。

主要参考资料

[1] 段昌群, 王焕校, & 曲仲湘. (1992). 重金属对蚕豆(vicia faba)根尖的核酸含量及核酸酶活性影响的研究. 环境科学(5), 31-954.

[2] 陈洁, & 王璋. (2000). 麦芽根中核酸酶的提取及制备. 食品工业科技(1), 19-21.

[3] 王道苑, 张卫, & 许帼英. (1987). 黄芪多糖对核糖核酸酶及其抑制因子平衡系统的保护作用. 中国中西医结合杂志(2), 93-96.