单宁酶的特点与蛋白质序列研究

单宁酶（Tannase），又称鞣酸酶，是一种单宁酰基水解酶，能够水解鞣酸等含双苯酚基的酸类物质，主要由黑曲霉、米曲霉等霉菌产生。单宁酶可应用于啤酒澄清、柿子脱涩及速溶茶制备，通过分解单宁与蛋白质复合物改善产品品质，因此单宁酶在食品加工和饮品澄清等领域具有重要的应用价值。

图1 植物乳杆菌单宁酶的生物结构

背景介绍

单宁是继纤维素、半纤维素和木质素之后第四类丰富的次生代谢产物，被认为是难降解且对机体有毒害的物质，但大量研究表明微生物、植物和动物中存在着一类能够降解单宁的水解酶——单宁酰基水解酶（单宁酶），如植物的果实、树叶、树枝和树皮等部位，鱼的消化道以及羊的瘤胃等部位。单宁酶能够催化没食子酸酯和单宁等底物中酯键和缩酚羧键的水解，释放没食子酸和葡萄糖。自被发现以来，单宁酶已被广泛应用于食品、饲料、制药和化学工业等行业；美国和日本等国家已将单宁酶审定为可用于食品工业的安全食品添加剂，我国卫生部2008年发布的第26号公文将单宁酶列入食品工业用加工助剂使用名单，因此单宁酶在食品及相关工业领域具有重要的应用价值和广阔的发展前景。[1]

来源与性质

单宁酶除存在于富含单宁的植物中外，还广泛存在于微生物中。能够产生单宁酶的微生物来源十分丰富，主要是真菌类的曲霉属、青霉属和根霉属，尤其是曲霉属中的黑曲霉、米曲霉和黄曲霉；此外，酵母菌、寄生内座壳菌、巴斯德菌、茄形镰刀菌和绿色木霉等也可产生单宁酶。单宁酶是一种糖蛋白，不同来源的单宁酶其分子量和糖链的含量有所差异，酶蛋白由2-8个单体聚合而成，糖基含量由12%到62%不等。不同来源的单宁酶温度和pH稳定性不同：单宁酶的最适温度较高的为50-60℃，一般在30-40℃之间，热稳定范围在60-70℃以下；来源于真菌和植物的单宁酶的最适pH一般为4.0-6.0，pH稳定性范围一般是3.0-7.0之间，细菌单宁酶的最适pH一般偏中性，因此不同来源的单宁酶在分子结构、糖基含量及温度、pH稳定性等方面均表现出一定差异。[1]

特点

单宁酶又称鞣酸酶，是一种单宁酰基水解酶。单宁酶除存在于富含单宁的植物中外，还广泛存在于微生物中。单宁酶对带有两个苯酚基的酸，能切断儿茶酚与没食子酸间的酯键，从鞣酸中释放没食子酸阴离子，对鞣酸具有水解作用。单宁酶可用于处理啤酒中单宁、蛋白质，使其澄清透明，亦可用于除去柿子等食品的涩味，以及用于制造速溶茶，防止发酵茶混浊等。单宁酶是将茶乳酪转溶的专一酶，它能断裂儿茶酚与没食子酸间的酯键，使苦涩味的酯型儿茶素水解，释放出的没食子酸阴离子又能与茶黄素、茶红素竞争咖啡碱，形成分子量较小的水溶性短链物质，从而降低茶汤的混浊度，提高原料的制取率，增加可溶性物质的含量，而且还能减轻一些苦涩味，增加茶叶的香气，因此单宁酶在啤酒澄清、食品脱涩和速溶茶制备等方面具有重要的应用价值。单宁酶可水解多酚类物质，从而起到澄清效果。单宁酶还可水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖，进而降低果汁中的涩味。单宁酶在pH 3.0～8.0之间均可发挥作用，其最适pH为4.0～6.0之间，热稳定范围在70～80℃以下，最适反应温度在35～60℃之间，因此单宁酶在不同pH和温度条件下均表现出一定的适应性和应用潜力。

蛋白质序研究

尽管许多微生物通过各种分析被鉴定为具有单宁酶活性，但在最近几年才开始陆续研究单宁酶的蛋白质序列，这为单宁酶的异源表达重组生产提供了理论基础。AMRITAB等从美国国家生物信息中心（NCBI）数据库中检索了149株细菌和36株真菌的单宁酶蛋白序列，其中只有77个细菌单宁酶和31个真菌单宁酶序列具有不同的氨基酸组成，并对这些序列进行了生物信息学分析，如理化性质、超家族搜索、多序列比对、系统发育树构建和基序发现等。这些单宁酶存在多种超家族，一些细菌和真菌的序列与不同的超家族有相似性。单宁酶蛋白序列的多重序列比对显示，在不同的序列上有保守区域，氨基酸残基389～469和482～523之间具有最大同源性，可用于设计单宁酶产生菌和真菌特有的简并引物或探针。系统发育树显示了两个不同的类群，一个只有细菌，另一个既有真菌又有细菌，显示了这些不同属之间的某种关系。虽然在第二簇中，几乎所有的真菌物种都被发现在一个角落里，这表明真菌属之间的序列水平相似性。14个基序的分布表明，基序1的特征氨基酸序列为29个氨基酸，即GCSTGGREALKQAQRWPHDYDGIIANNPA，在83.3%的单宁酶序列中均能观察到，它参与了结构和酶功能。对细菌和真菌来源的单宁酶蛋白序列进行了分析，序列水平的相似性可用于设计基于简并引物聚合酶链式反应（PCR）扩增的基因克隆。来自细菌和真菌的序列有着基本的关系，因为它们具有基序特性。基于单宁酶蛋白序列相似性的信息也可以用来研究细菌和真菌之间进化关系的一部分。另一方面，理化参数分析可以用来预测单宁酶的结构，因此单宁酶蛋白序列的研究对于理解其进化关系、结构特征及重组生产具有重要意义。

参考文献

[1] 苏二正,夏涛,张正竹.单宁酶的研究进展[J].茶业通报, 2004, 26(1):4.