粘蛋白的制备及应用

发布日期:2020/10/18 17:56:53

背景及概述^[1][2]

粘蛋白是一类高度糖基化的蛋白，它由蛋白和寡糖链两部分组成，且糖链含量一般在50％～80％之间。该类粘蛋白寡糖链主要以O-连接的形式与蛋白骨架上的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)结合，称之为O-糖链。大量研究表明，正常动物小肠黏膜上皮细胞表面黏液层中含有大量粘蛋白，除了具有保护上皮细胞免受物理或化学损伤外，还参与预防多种疾病的发生和发展的功能，如预防囊肿纤维化症(Cystic Fibrosis，CF)、粘液腺癌、炎症性肠炎等。粘蛋白上的O-糖链结构复杂，活性广泛，在小肠细胞间相互作用、信号调控、分子运输等中发挥重要的调控作用，直接影响生物体的生长发育与疾病的预防。

制备^[1-2]

一、一种从猪小肠黏膜提取肝素后的废弃物中提取粘蛋白的方法

(1)酶解：将猪小肠黏膜肝素加工废弃物悬浮于Tris-HCl缓冲液中，升温至37℃，加入胰蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解结束后，煮沸，使酶失活；

(2)醇沉：将(1)中所得酶解液离心，上清液中加入乙醇进行沉淀，静置12～24h，收集沉淀，上清液旋蒸浓缩，烘干，用作动物饲料；

(3)透析：将(2)中沉淀用蒸馏水复溶，转入透析袋中，透析，去除小分子物质，透析结束后，将透析内液旋蒸浓缩，冻干，获得粘蛋白粗提物；

(4)纯化：将(3)所得粘蛋白粗提物用蒸馏水溶解，以蒸馏水和不同浓度的氯化钠水溶液为流动相，经强阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测，合并收集含有粘蛋白的组分，蒸馏水透析，减压浓缩，冻干，获得高纯度粘蛋白。

二、一种鸡卵类粘蛋白(Hen-egg ovomucoid，缩写为HOVM)的纯化工艺，包括下述步骤：在pH值为2.5-3.5的鸡卵类粘蛋白干粉粗品复溶所得水溶液或鸡卵类粘蛋白粗提液中加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为50-70％(w/v)，4-25℃下放置4h以上，使杂蛋白沉淀，鸡卵类粘蛋白溶解，之后，4℃下离心，弃沉淀取上清液；所得上清液中再加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为80-100％(w/v)，4-25℃下放置4h以上，使杂蛋白溶解，鸡卵类粘蛋白沉淀，之后，于4℃离心，弃上清液取沉淀，所得沉淀经透析除盐和冷冻干燥得到高纯度的鸡卵类粘蛋白。图1所示为所得HOVM蛋白样品在检测波长为220nm下HPLC 法纯度检测色谱图。

应用^[3]

CN201710897384.5一种基于贻贝粘蛋白的美白面膜，其特征在于，包括如下重量份的成分：0.5-2份贻贝粘蛋白、0.5-2份聚乙烯醇、1.5-2份羧甲基纤维素钠、0.2-0.8份维生素E、7-8份甘油和 80-120份去离子水。制备方法包括如下步骤：

(1)根据上述一种基于贻贝粘蛋白的美白面膜称取各成分；

(2)将去离子水和聚乙烯醇加入到混合容器中，升温搅拌至聚乙烯醇完全溶解，得到聚乙烯醇溶液；

(3)将步骤(2)制备得到的聚乙烯醇溶液进行降温处理，加入羧甲基纤维素钠，搅拌至混合均匀，得到羧甲基纤维素钠和聚乙烯醇的混合溶液；

(4)将甘油加入到由步骤(3)制备得到的混合溶液中，搅拌至溶液混合均匀，得到甘油混合溶液；

(5)将贻贝粘蛋白加入到步骤(4)制备得到的甘油混合溶液中，搅拌至溶液混合均匀，得到贻贝粘蛋白混合溶液；

(6)将维生素E加入到步骤(5)制备得到的贻贝粘蛋白混合溶液，搅拌，然后放入模具中，静置处理，揭膜，即可得贻贝粘蛋白美白面膜。

本发明以贻贝粘蛋白、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、甘油、维生素E、去离子水等为原料，制备得到一种基于贻贝粘蛋白的美白面膜。其无毒、无刺激、无副作用，被人体吸收快，美白效果好，并且使用后的面膜废弃物可生物降解、无污染。其中使用的贻贝粘蛋白具有美白效果。黑色素一般在皮肤基底层的细胞中间合成，合成过程为：先由体内酪氨酸和酪氨酸酶反应形成多巴(DOPA)，再由多巴形成多巴醌，最后形成多巴色素，整个合成过程均为氧化反应。而贻贝粘蛋白中含有的DOPA与色素形成过程中的DOPA一样，也是酪氨酸在酪氨酸酶作用下反应形成的。

由于氧化DOPA和未氧化 DOPA会相互交联，形成高聚物，所以贻贝粘蛋白的DOPA可与黑色素形成过程中生成的DOPA 反应，形成高聚物，从而中止黑色素的形成。同时贻贝粘蛋白还可以作为还原剂，抑制DOPA 的氧化反应，进而抑制黑色素的生成。使用的维生素E为细胞膜上的重要组成成分，亦是细胞膜上的主要抗氧化剂，使用过程中同样可以抑制DOPA的氧化反应，进而抑制黑色素的生成，可以起到美白的作用。