酶促转酯反应合成乙酸癸酯

乙酸癸酯是橙子、柠檬、甜瓜、苹果、柑橘皮油、橙汁、草莓果、蓝奶酪、白兰地、李子和小豆蔻等中含有的一种天然成分，具有花香、橙香和玫瑰香气味，在高度稀释状态下，具有菠萝样甜味，是重要的芳香气昧添加剂，广泛应用于食品和化妆品工业，如酒精和非酒精型饮料、明胶、布丁、焙烤食品、软硬糖果、口香糖和冷冻乳制品等。

基于食品行业对天然添加剂的大量需要和生态环保的考虑，人们倾向于用环境友好的工艺生产绿色天然的成分，如生物酶催化过程，可以避免化学工艺过程中的酸性和高压条件，在温和条件下制备天然成分。特别是在非水条件下，脂肪酶催化的转酯反应，可避免水解反应的发生，利于提高产物的纯度。并可以通过酶固定化，提高酶催化活性和稳定性，以及简化酶与反应液的分离。通常，脂肪酶在水/油(有机相)界面上，酶被水相优化;同时酶活性部位上的‘盖子’结构--一段可移动的a-螺旋，被有机相打开，所以脂肪酶有优异的界面催化活性。许多脂肪酶的固定化研究，正是要稳定酶的优势蛋白构象并保持其盖子结构处于敞开状态，以提高其在非水相中的催化活性和稳定性。本文选用亲水性大分子羧甲基纤维素(CMC)，代替界面上的水分子，通过固定化，稳定荧光假单胞脂肪酶(Pseudomonas fluorescenslipase,PFL)，用于催化癸醇与乙酸乙烯酯反应合成乙酸癸酯，取得了较理想的效果。

合成方法^[1]

1、脂肪酶PFL的固定化

取10mg酶粉置于10mL柱形玻璃瓶中，再加入0.2mL水或0.2mL浓度为0.05%的CMC溶液。敞口置于全温振荡器中，在37℃和160r/min条件下，保持7h以上，即得吸附在瓶壁上的固定化PFL。

2、酶促转酯反应

在固定有PFL的柱形瓶或加有10mg酶粉PFL的柱形瓶中，加入正癸醇(1.9mL，10moL)和乙酸乙烯酯(2mL，21.6moL)，拧紧盖子，并使用封口膜密封，固定在恒温振荡培养器中，在37℃和160r/min条件下，催化反应。乙酸癸酯的转化率c(%)由GC分析确定。

3、酶动力学分析

每反应2h，用取液器，从柱形瓶反应器中取20uL反应液，使用0.5mL正己烷稀释，并用直径为0.25um的有机滤膜过滤，用于气相色谱分析。气相分析条件为:氦气，0.4MPa,分流比为1:1，流量1.7mL/min;柱温程序，130℃，1min，50℃/min，280℃，2min;进样温度250℃，检测温度280℃。癸醇和乙酸癸酯的保留时间分别为3.4和4.1min。

4、PFL的循环应用

向含CMC-PFL固定化酶、水-PFL固定化酶和PFL酶粉的三个柱形瓶反应器中，如步骤3部分，分别加入正癸醇和乙酸乙烯酯，密封后，放入恒温振荡器振荡催化反应。24h后，如步骤3部分，GC分析c，并将反应液分别从反应器中倒出。再加人新的反应液，催化反应24h，并分析c。如此，操作5次。

5、CMC-PFL催化反应实验放大

以500mL三角烧瓶作为反应器，加入0.5 g的PFL酶粉，以及10mL浓度为0.05%的CMC溶液，进行酶固定化。固定化条件与步骤1部分相同。向固定化完半的反应器内，加入112mL正癸醇和88mL乙酸乙烯酯(mol : mol,1 :1.5)催化反应，温度和摇荡速度同前。每24h取样GC分析一次。96h后，转化率达到99%以上，倒出反应液，用石油醚清洗，洗液与反应液合并，旋转蒸发，得乙酸癸酯128.5mL，收率94.6%。再次向反应器加入初始反应液，催化96h，转化率降低到95.5%。倾出反应液用石油醚洗涤，加10mL水重复固定化操作，再加入初始反应液，催化96h，乙酸癸酯转化率再次达到99%以上。

参考文献

[1]丁俊竹,丛方地,詹美榕,等. 固定化荧光假单胞菌脂肪酶催化合成乙酸癸酯[J]. 中国食品添加剂,2017(3):122-126. DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2017.03.012.