昆虫基因组DNA提取试剂盒

背景^[1-6]

昆虫基因组DNA提取试剂盒采用独特的裂解液能够有效除去多糖多酚等，能够从昆虫、软体动物、节肢动物、蛔虫等样品中提取DNA，保存在在醇类的样品也适用于本试剂盒的提取。一次操作可以处理小于50mg组织，样品经裂解液消化，氯仿分离除去大部分的多糖多酚，再经分离柱进一步纯化，便可得到高纯度的DNA。所得的DNA可以用于PCR，Southern杂交，酶切消化等实验。昆虫基因组DNA提取试剂盒专门为从昆虫等低等非脊索动物，包括某些植物组织中提取基因组DNA而设计。该方法结合了CTAB裂解法和硅胶柱纯化方式，能有效地去除各种色素，甲壳素，多糖等杂质。

纯化的DNA可直接用于PCR，Southern杂交，酶切等后续实验。昆虫组织(细胞)磨碎成粉末后，用CTAB裂解液裂解,氯仿抽提去除多聚糖等物质后，异丙醇沉淀初步纯化DNA，重新溶解DNA加入乙醇调节DNA与柱子的结合条件，过柱进一步纯化DNA，通过两步快速地洗涤柱子以去除杂质，最后用灭菌水或低盐缓冲液溶解并洗脱出DNA。标准操作步骤：

如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1.液氮充分研磨样品。

2.收集研磨成粉末的50mg样品，置于1.5ml离心管中。

3.加入350μl65℃预热的缓冲液IL，并加入20μl蛋白酶K剧烈地漩涡振荡，确保所有的组织团都分散均匀。

4.65℃水浴20-30min。水浴期间颠倒样品数次。

5.加入350μl氯仿，充分混匀，12,000 rpm(~13,400×g)离心5分钟。

6.小心地把上清液吸至另一新的1.5ml离心管中。注意确保不要打散沉淀团或把组织碎片也一起转移。

7.加入4μl RNase A，涡旋混匀。室温放置2min。

8.加入二分之一上清体积的缓冲液IB与等体积的无水乙醇，充分混匀。如：向300μl上清中加入150μl缓冲液IB与300μl无水乙醇。

9.把上述混匀的液体转移到吸附柱上。10,000×g离心1 min以结合DNA，弃去滤出液体。纯化柱容量为750μl,如果混合液大于750μl,请分两次过柱。

10.将吸附柱重新套回收集管中，加入500μl缓冲液WB至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；

11.将吸附柱重新套回收集管中，加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；

注意：DNA Wash Buffer使用前须按要求用无水乙醇稀释。如果放入冰箱中，使用前须恢复到室温。

12.再加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，8,000×g离心1min,弃去流出液；

13.将吸附柱重新套回2ml收集管中，转速（>13000×g）离心空结合柱1min以干燥柱子的基质；这一步对下面的洗脱步骤至关重要。

14.将柱子置于1.5ml灭菌离心管，加入50-150μl65℃预热的洗脱缓冲液EB至柱子的膜中央。室温静置5min；

15. 室温下，离心(>13000)1min，以洗脱DNA。保留含DNA的流出液。将DNA储于-20℃。

DNA浓度及纯度检测：

基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。提取的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。可配制0.8-1.0％琼脂糖凝胶，使用λ/HindIII判断基因组的大小，完整的基因组大小应在23kb以上。使用分光光度计检测时，OD260/OD280比值应为1.7–1.9之间，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水洗脱，比值可能偏低，但并不表明DNA纯度不高。

应用^[7][8]

昆虫基因组DNA提取试剂盒可用于昆虫基因组DNA提取：

对该物种基因组微卫星特征和变异进行了较深入地分析,并优化了鳞翅目成虫DNA提取的技术方法。将传统的蛋白酶K+SDS+苯酚抽提方法和CTAB方法结合起来,筛选出从东方粘虫成虫自然种群的乙醇保存标本中提取高质量、高产量基因组DNA的方法,用于制备分离微卫星标记所需的DNA样品。

对比研究结果表明,用CTAB+传统方法提取DNA时,取腹部中段10-20 mg组织样品进行实验,不同种群DNA产品合格率68.42%-95.28%,提取合格DNA量5.59-10.04 mg/g,显著高于传统蛋白酶K+SDS裂解及苯酚抽提方法的7.69%-40%和2.83-5.78 mg/g。另外,用热NaOH法快速制备用于大规模基因分型的DNA样品的研究结果表明,对于胸部和腹部组织样品,用热NaOH溶液处理20 min,就能够提取出微卫星PCR扩增反应所需的DNA样品；对于头部组织样品,用热NaOH溶液处理40-60 min是比较合适的。

参考文献

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