CDC34兔单克隆抗体

背景^[1-7]

Cdc34 Rabbit Monoclonal Antibody(CDC34兔单克隆抗体)是CDC34作为抗原对兔进行免疫后筛选出只产生的CDC34抗体的B淋巴细胞，再将B细胞通过细胞融合技术与骨髓瘤杂交然后筛选出只分泌CDC34抗体的杂交瘤细胞，最后通过层析柱纯化制的高纯度的CDC34抗体兔单克隆抗体。由Cdc34基因编码的蛋白质是遍在蛋白缀合酶家族的成员。遍在蛋白缀合酶催化遍在蛋白与其他蛋白质的共价连接。该蛋白质是大型多蛋白复合物的一部分，其是遍在蛋白介导的细胞周期G1调节剂降解和DNA复制起始所必需的。

泛素-蛋白酶体系统（UPS）控制几乎所有细胞过程中数千种蛋白质的稳定性，相互作用和定位。泛素与底物赖氨酸残基的缀合由保守的酶促级联催化：E1酶以ATP依赖性方式激活泛素作为硫酯，并将活化的遍在蛋白转移至E2的催化半胱氨酸残基，然后E2与E3酶相互作用。将遍在蛋白作为异肽结合到基质上。E3酶，也称为泛素连接酶，通过特定的蛋白质相互作用域赋予底物特异性，并分为两大类：HECT结构域类形成催化泛素硫酯中间体，而RING结构域类将带电荷的E2并置在底物旁边。

在人类基因组编码两个E1酶，至少38种E2酶，以及超过600种不同E3酶，其中的每一个具有潜力来识别多个基板。的E3酶家族，cullin-RING连接酶（CRLs），最初被发现为多亚基Skp1-Cdc53/Cullin-F盒蛋白（SCF）泛素连接酶。SCF复合物包含核心亚基Skp1，Cdc53/Cul1和Rbx1/Roc1/Hrt1以及一组称为F box蛋白的衔接子亚基，其通常以磷酸化依赖性方式募集特定底物至核心复合物。

至于所有人RING结构域E3酶，SCF复合物捕获底物用于E2介导的遍在蛋白化，但本身不具有催化活性。基于类似的衔接子-cullin-RING结构构建的SCF样复合物包括促进复合物/环状体的后期和基于Cul2-，Cul3-，Cul4A-，Cul5-和Cul6-的泛素连接酶。因此，CRL类具有靶向数百种（如果不是数千种）蛋白质降解的能力。CDC34（细胞分裂周期34）是蛋白质编码基因。

其相关途径包括TCR信号传导（REACTOME）和CLEC7A（Dectin-1）信号传导。与该基因相关的基因本体论（GO）注释包括连接酶活性和遍在蛋白连接酶结合。CDC34在控制细胞周期和DNA复制中很重要。与不同的E3复合物（包括SCF）相关的Cdc34已经显示出在细胞分裂，信号转导和发育过程中靶向许多不同的底物以进行泛素化和降解。

已经表征的Cdc34底物包括IκB，B-Myb，Wee1，MyoD，ICERIIα，ATF5，p27Xic1和p27Kip1。另外，由于它们对蛋白水解的SCF要求，诸如β-连环蛋白，p21Cip1，E2F，细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白D的底物是Cdc34的推定底物。已经证明Cdc34通过C末端的结构域自缔合，并且在体内被磷酸化和泛素化。该蛋白质可用于体外泛素化反应。

应用^[8][9]

CDC34兔单克隆抗体可用于CDC34活性半胱氨酸对自身稳定性的调控及CDC34相互作用蛋白的鉴定与功能研究：

细胞内许多蛋白质的降解都依赖于泛素蛋白酶体系统(UPS),在该系统中有3种非常重要的酶,泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3。泛素蛋白酶体系统的失调与许多人类疾病,如癌症、免疫性疾病、神经退行性疾病以及病毒感染等关系甚密。CDC34(cell division cycle 34)蛋白,是E2泛素结合酶家族中的一员,它能联合E3泛素连接酶复合体(SCF,Skp1-Cullin 1-F-box protein)泛素修饰靶蛋白。CDC34可以产生有K48连接的多聚泛素链,从而利用蛋白酶体降解这些泛素化靶蛋白。

近年来发现CDC34能通过对p27Kip1蛋白水平的调节来调控细胞的增殖,CDC34对p27Kip1蛋白水平的不正常调节已被证实与人二倍体成纤维细胞的增殖有关。有研究表明,CDC34能在HCC(hepatocellular carcinomas)细胞(肝癌细胞)的细胞质及细胞核中过表达,发现它对肝细胞癌的增殖和分化有着促进作用。CDC34的活性位点93位的半胱氨酸进行了点突变,探索了突变体对其自身泛素化和稳定性的影响,使用野生型和突变体来纯化并用LC-MS/MS寻找CDC34相互作用蛋白,然后对这些蛋白进行了验证和相互调控关系的研究。

研究方法:构建带有Strep-FLAG标签的野生型CDC34以及突变型的CDC34 C93S质粒,在HEK293T细胞中表达CDC34野生型和突变体,蛋白免疫印迹在全蛋白中检测野生型和突变体的表达情况,检测活性位点突变对CDC34自身稳定性和泛素化的影响。

参考文献

[1]Ubiquitylation,neddylation and the DNA damage response[J].Jessica S.Brown,Stephen P.Jackson.Open Biology.2015(4)

[2]MCM7 serves as a prognostic marker in diffuse-type gastric adenocarcinomaand siRNA-mediated knockdown suppresses its oncogenic function[J].Wei Kang,Joanna Tong,Anthony Chan,Alfred Cheng,Jun Yu,Kafai To.Oncology Reports.2014(5)

[3]Ubiquitin-conjugating enzyme E2C:A potential cancer biomarker[J].Chanlu Xie,Chris Powell,Mu Yao,Jianmin Wu,Qihan Dong.International Journal of Biochemistry and Cell Biology.2014

[4]Molecular and structural insight into lysine selection on substrate and ubiquitin lysine 48 by the ubiquitin-conjugating enzyme Cdc34[J].Randy Suryadinata,Jessica K.Holien,George Yang,Michael W.Parker,Elena Papaleo,Boris Sarcevic.Cell Cycle.2013(11)

[5]The Ubiquitin–Proteasome System and Cardiovascular Disease[J].Saul R.Powell,Joerg Herrmann,Amir Lerman,Cam Patterson,Xuejun Wang.Progress in Molecular Biology and Translational Science.2012

[6]MDM-2 antagonists induce p53-dependent cell cycle arrest but not cell death in renal cancer cell lines[J].Chun Chui Tsao,Paul G.Corn.Cancer Biology&Therapy.2010(12)

[7]Regulation of apoptosis by the ubiquitin and proteasome pathway[J].CezaryWójcik.Journal of Cellular and Molecular Medicine.2007(1)

[8]A Genomic and Functional Inventory of Deubiquitinating Enzymes[J].Sebastian M.B.Nijman,Mark P.A.Luna-Vargas,Arno Velds,Thijn R.Brummelkamp,Annette M.G.Dirac,Titia K.Sixma,RenéBernards.Cell.2005(5)

[9]刘勋.CDC34活性半胱氨酸对自身稳定性的调控及CDC34相互作用蛋白的鉴定与功能研究[D].苏州大学,2016.