烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备

背景及概述^[1-2]

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸又称辅酶Ⅰ。脱氢酶辅酶的一种。为烟酰胺核苷酸与腺嘌呤核苷酸的缩合物，存在氧化型和还原型两种形式，分别简写成NAD⁺和NADH+H⁺。含有维生素B₅，其烟酰胺吡啶环在反应中可以可逆地进行脱氢和得氢(或得失电子)作用。为一些不需氧脱氢酶的辅酶，在生物体内起传递氢的作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸主要存在于酵母细胞线粒体中，目前通常选用破壁和提纯的方法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，常用的破壁方法有温差法(热处理法)和高压均浆法，温差法破壁效果不理想，高压均浆法不适合工业化大生产，常用的提纯方法为柱洗脱，但是柱洗脱过程繁琐，耗时长，不利于工业化生产，溶剂使用量大，污染环境，制得的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纯度低，收率低。因此需要提供一种新的制备方法。

功能^[3-5]

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸参与细胞物质代谢、能量合成、细胞DNA修复等多种生理活动，对机体免疫能力有重要作用。在健康状态下，人体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度稳定，维持各项细胞正常功能。体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度决定了细胞衰老的过程和程度，浓度下降会加速细胞衰老的过程。

研究表明，NAD+对缺血手术引起的肾脏梗死具有保护作用，可以显著减少血清中尿素氮、肌酐水平；NAD+对缺血手术引起的肾小管损伤具有保护作用。NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，Nicotinamideadeninedinucleotide，简称NAD+)可以有效保护肾脏缺血引起的肾脏损伤，NAD+在制备防治肾脏缺血性损伤药物中有重要应用价值。

另外，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在制备治疗炎性痛药物中具有一定的应用，NAD+通过依赖NAD+的去乙酰化酶SIRT1和SIRT2参与调节福尔马林和完全弗氏佐剂(CFA)诱发的炎症痛，而SIRT1和SIRT2通过不同机制参与NAD+对炎症痛的抑制作用，从而达到对炎性痛具有镇痛的作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在制备防治化疗药物盐酸阿霉素诱导的肝脏损伤药物中也具有的应用，NAD+不但可以有效防治化疗药物盐酸阿霉素造成的肝脏损伤，而且我们还发现NAD+可以有效杀死神经胶质肿瘤细胞、神经元肿瘤细胞、胃癌肿瘤细胞、肾癌肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞，对于正常原代细胞没有杀伤作用。

制备^[1]

一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括如下步骤：

S1、破碎细胞：将酵母细胞加入质量分数为0.04wt％盐酸水溶液中浸泡2.5h，进行温差破壁处理后，用孔径为40nm的陶瓷膜过滤，取滤液得到清液A，其中，酵母细胞和盐酸水溶液的重量体积(g/ml)比为5：16；

S2、浓缩：取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调节浓缩液B的pH＝2.5得到浓缩液C，其中，超滤膜的截留分子量为4000D，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为300D；

S3、洗脱：将S2中得到的浓缩液C过D152树脂柱，用浓度为0.1mol/l的氨水洗脱，收集洗脱液D，用核酸蛋白检测仪检测洗脱液D至核酸蛋白检测仪读数为570时停止洗脱，用盐酸水溶液调节洗脱液D的pH＝7后，过717树脂柱，用浓度为0.3mol/l的氯化钾水溶液洗脱，收集得到综合液E，用核酸蛋白检测仪检测综合液E至核酸蛋白检测仪读数为≤200时停止洗脱；

S4、分离：将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F；用硝酸水溶液调节浓缩液F的pH＝1，加丙酮沉淀，离心得到固体G，其中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为300D，浓缩液F和丙酮的重量比为1：4；

S5、纯化：将S4中得到固体G加水溶解，过固定相为改性硅胶的制备色谱，脱盐，分离，收集分离液，浓缩，冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中，固体G和水的重量体积(g/ml)比为2：5，脱盐时用质量分数为1wt％甲醇水溶液以30ml/mim的速度洗涤，其中，固体G、甲醇水溶液的重量体积(g/ml)比为1：80，分离时用30min内，质量分数由3wt％匀速增至10wt％的甲醇水溶液梯度洗脱，其中，洗脱速度为30ml/min，2g的固体G所用洗脱时间为30min。

主要参考资料

[1] 农业大词典

[2] CN201511022464.3一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法

[3] CN201710064412.5烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在制备预防或治疗肾脏缺血性损伤药物中的应用

[4] CN201710469665.0烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在制备治疗炎性痛药物中的应用

[5] CN201210252579.1烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在制备防治化疗药物盐酸阿霉素诱导的肝脏损伤药物中的应用