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乌苯美司的作用机制有哪些

发布日期:2019/5/14 14:12:10

背景及概述[1][2]

乌苯美司是1976年由日本学者梅泽滨夫从橄榄网状链霉的培养液中分离而得的一种低分子二肽化合物,化学名为N-[(2S,3R)-3-氨基-2-羟基-4-苯丁酰]-L-亮氨酸,呈白色结晶粉末状,易溶于冰醋酸,在水或甲醇中微溶。1987年作为具有免疫调节功能的抗癌辅助药在日本正式上市,国内商品名为百士欣,属于国家二类新药并于1998年上市应用,由四川抗生素工业研究所研制,浙江普洛康裕制药有限公司生产,且目前市场上的片剂和胶囊剂具有生物等效性。乌苯美司的临床试验中出现的不良反应主要有皮疹、红斑以及胃肠道反应,继续服药或停药后绝大部分症状会自行消失。乌苯美司作为氨肽酶抑制剂,在阻抑肿瘤细胞生长、抑制肿瘤侵袭和转移等方面体现了一定的抗肿瘤效果,与其他药物联合使用时发挥了较显著的协同抗癌功能,并在免疫方面起到了不可忽视的调节作用。

作用靶点[1]

现有研究显示乌苯美司最主要的抑制靶点为氨肽酶,此酶通过水解肽段氨基端上氨基酸来降解细胞外基质和基底膜,进而促进肿瘤的转移,在一些高侵袭性、快速增殖的恶性肿瘤中表达上调。乌苯美司可通过结合氨肽酶的Zn2+和疏水活性中心抑制氨肽酶的活性。目前在乌苯美司抑制的十几种氨肽酶中,研究较多的是氨肽酶N(aminopeptidaseN,又称CD13)和氨肽酶B,其中又以CD13最为重要。除上述氨肽酶的共同水解作用影响肿瘤侵袭转移之外,CD13还与血管形成、病毒受体、抗原呈递、调节细胞因子相关。在2008年研制的具有乌苯美司活性的高效探针可更广泛地检测金属氨肽酶在不同生物系统中的功能特性。

除了靶向氨肽酶,乌苯美司另一个抑制靶点是白三烯A4(leukotrieneA4,LTA4)水解酶,两者结合过程中Glu-296是重要的结构决定因素。此外,有研究者发现乌苯美司还是一种肿瘤二肽酶的竞争性抑制剂,此酶从小鼠腹水肿瘤细胞中分离纯化得到,与氨肽酶结合方式不同的是,乌苯美司与二肽酶结合过程虽缓慢,但并不紧密。综上,乌苯美司的作用靶点主要为氨肽酶和LTA4水解酶。

作用机制[1]

早期认为,乌苯美司在体内的抗肿瘤活性是通过影响机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞的,如激活免疫细胞巨噬细胞,降解灭活免疫活性因子,活化粒细胞和NK细胞,促进抗肿瘤非特异性免疫反应等,随后大量研究发现即使不通过免疫反应,乌苯美司依然具有抗肿瘤作用,因而乌苯美司的抗肿瘤作用包括直接的以及通过免疫调节产生的间接抗肿瘤作用。

1. 细胞增殖抑制作用与细胞凋亡诱导作用

2000年发现人早幼粒急性白血病细胞系HL60细胞增殖可被乌苯美司抑制。乌苯美司还可直接诱导慢性粒细胞性白血病细胞K562细胞产生凋亡效应,抑制细胞增殖。该过程依赖于caspase-3的活化,还与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的磷酸化以及细胞周期蛋白D1表达受到抑制有关。在正常大肠癌细胞中死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子是呈甲基化状态的,而用乌苯美司处理细胞后,该基因启动子逆转为去甲基化状态,DAPKmRNA和蛋白均恢复表达,细胞增殖被抑制并发生凋亡。另有文献表明乌苯美司及其类似物通结合BIR3结构域,致使凋亡抑制因子1自动泛素化从而被降解,最终导致肿瘤细胞发生凋亡。此外发现在人实体瘤细胞中,乌苯美司在不引起肿瘤细胞亡的情况下能促进Fas激动性抗体CH11诱导肿瘤细胞(人类宫颈癌细胞HeLaS3和纤维肉瘤细胞HT-1080)凋亡,增强caspase-8的活化。目前,在已成功合成的乌苯美司类似物中,LYP更有效地在体内抑制卵巢癌ES-2移植瘤的生长,其中LYP2可抑制包括HL60、A549及PLC等6种肿瘤细胞生长,IC50值均低于乌苯美司,而且LYP3在ES-2和HL60肿瘤细胞中的生长抑制作用同样优于乌苯美司。且上述类似物具有更好的水溶性及生物稳定性,在未来的研究中可能成为乌苯美司的有效替代物。

2.  侵袭转移抑制作用

大量研究发现,在转移性肿瘤中,乌苯美司可通过抑制CD13活性进而遏制肿瘤细胞侵袭转移,并呈乌苯美司药物浓度依赖性,同时伴随小鼠存活时间的延长。早期学者发现乌苯美司可显著下68kDIV型胶原蛋白酶蛋白(活性形式)的表达水平,乌苯美司对肿瘤细胞侵袭的抑制作用可能与其影响IV型胶原蛋白酶由潜在形式向活性形式的转化过程及肿瘤细胞胶原酶的分泌过程有关。近年来,发现人骨肉瘤细胞经乌苯美司给药处理后,MAPK与PI3K蛋白表达水平以及p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平降低,NF-κB蛋白水平降低,同时还检测到肿瘤侵袭转移相关标志性蛋白分子基质金属蛋白酶(MMP)2和MMP9的酶活性及表达水平被抑制,肿瘤侵袭现象减弱。尽管CD13在前列腺癌细胞中表达含量不高,乌苯美司同样可以通过下调CD13表达来遏制细胞侵袭与转移,伴随LC3B蛋白表达上调以及自噬性细胞死亡,在肾癌细胞中给药后出现了上述类似现象,但乌苯美司是通过阻碍CD13活性,而非影响其表达含量来体现抑制细胞侵袭作用的。

3.  血管形成抑制作用

CD13在肿瘤血管生成过程中发挥重要作用,经肿瘤微环境的影响因素低氧或血管形成生长因子刺激后,人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)中CD13的表达升高,HUVECs的血管形成能力增强,乌苯美司能抑制HUVECs在基底膜基质中形成毛细管网络的能力,这种血管形成抑制作用可能与乌苯美司抑制CD13的表达相关。过绒毛膜尿囊膜血管实验发现,乌苯美司可抑制成纤维细胞生长因子2(FGF-2)所引发的血管形成过程,另在视网膜新生血管形成模型中,同剂量乌苯美司也可阻断低氧环境下的血管生成。此外,乌苯美司类似物LYP能够更加有效抑制CD13的活性,通过抑制血管内皮细胞毛细管的形成达到抗肿瘤作用。

4. 免疫调节作用

长久以来,乌苯美司主要用于肿瘤的辅助治疗,提高机体免疫力,减轻化疗中的不良反应,提高患者生活质量。大量文献显示,乌苯美司用于胃癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、急性髓系白血病、肾癌等恶性肿瘤的临床试验和治疗,乌苯美司会通过增加患者外周血中CD3+、CD4+淋巴细胞数量,高CD4+/CD8+比值,改善NK细胞活性,调节免疫因子,增强NO分泌能力及巨噬细胞吞噬功能,使外周血髓系衍生抑制细胞(myeloidderivedsuppressorcells,MDSCs)和肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages,TAMs)恢复至正常水平等生物效应来改善机体免疫机能。2016年和2017年,研究者分别对纳入标准的9项随机对照试验(810例患者)以及12项随机对照试验(762例患者)进行Meta分析,收集评价乌苯美司对恶性肿瘤患者的免疫影响,结果证实了上述观点。在临床前基础分子机制研究方面,科学家们的关注点主要集中在乌苯美司对机体中免疫效应细胞因子的影响,除可增加IL-1和IL-2的分泌外,乌苯美司还可抑制促炎性细胞因子及趋化因子,如IL-6、CXCL8/IL-8、CCL3/巨噬细胞炎症蛋白-1α等的生成及表达。

药代动力学[1]

乌苯美司在体内作用时间较短,成人单次口服30mg后1h血药浓度达到峰值(2.2μg/ml),随后呈双相性下降,主要分布于肝脏、肾脏和小肠,极少数进入红细胞和骨骼肌。免疫细胞化学方法结果显示,乌苯美司在小肠中主要分布于上皮细胞微绒毛、胞质与胞核中,并在有寡肽转运蛋白(peptidetransporter,PEPT)1和PEPT2存在的部位大量聚集,且涉及有机阴离子转运蛋白(OAT)1和OAT3的参与。经体内代谢后,乌苯美司的原型以及两种生物活性代谢产物(-)-N-[(2S,3R)-3-amino-2-hydroxy-4-(4'-hydroxy)phenylbutyryl]-L-leucine(OH-ubenimex)和(2S,3R)-3-amino-2-hydroxy-4-phenylbutyricacid[(2S,3R)-AHPA]分别以67%~73%、9%~25%和2%~5%的比例随尿液排出,因此,乌苯美司主要以原型形式排泄。

当乌苯美司与其他药物联合用药时,会产生药物-药物相互作用(DDIs)。有文献指出,氨甲蝶呤与乌苯美司的DDI药代动力学机制为:两者在肠黏膜中均由P-糖蛋白转运,在肾脏中均由OAT转运。而在肾脏中头孢克肟和乌苯美司DDI靶标转运蛋白为PEPT1和OAT1/3[8]。体内体外实验证实,P糖蛋白抑制剂可显著增加乌苯美司在肠道内的吸收,并增强其药效。白藜芦醇通过下调多药耐药基因(multidrugresistance,Mdr)1和Mdr2、上调PEPT1蛋白的表达水平来促进乌苯美司在肠道中的吸收。

适应症[2]

用作免疫功能增强剂,用于癌症化疗、放疗的辅助治疗,可用于白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征及造血干细胞移植后;也用于其他实体瘤,还用于老年性免疫功能低下等。

用法与用量[2]

口服:每日30mg,早晨空腹顿服或分3次服用,症状减轻或长期服用时,每周服2~3次。

不良反应[2]

不良反应少而轻,总发生率约为2.43%。偶有口内不适感、恶心、呕吐及腹泻等胃肠道反应;个别有肝损伤,可出现血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)一过性轻度升高,在服药过程或停药后消失;偶有头痛、麻木感;可见皮肤发红、轻度脱发、皮疹、瘙痒。偶有面部浮肿。

注意事项[2]

对孕妇和哺乳期妇女以及儿童的安全性未确立,应慎用。每日剂量超过200mg,可使T细胞数减少。

制剂与规格[2]

片剂:10mg;胶囊剂:10mg、30mg。

联合用药[1]

由于肿瘤的复杂性,对于一些难治愈、易复发的恶性肿瘤,传统治疗手段如放疗、化疗的治愈效果并不明显,旨在提高疗效的联合用药策略将是未来治疗癌症之大方向。乌苯美司现与多种化药联合用于治疗肿瘤,效果明显。近期研究

表明,乌苯美司联合化疗药物5-氟尿嘧啶、阿霉素、亚叶酸钙等治疗肝动脉栓塞中晚期复发性肝癌(尤其是肿瘤直径<3cm及3~5cm的小肝癌)时,会增强细胞凋亡以及细胞内活性氧水平,治疗效果优于单纯化疗。对于晚期胃癌,与替吉奥联合奥沙利铂化疗方案联用后,乌苯美司能降低患者血清MMP2及MMP9水平,增强抗肿瘤效果。乌苯美司还可加强全反式维甲酸对急性早幼粒细胞白血病细胞增殖的抑制作用及诱导细胞分化的能力。此外,乌苯美司可显著提高顺铂对A549细胞生长抑制作用,其或成为CD13+非小细胞肺癌顺铂治疗的增敏剂。

制备[3]

乌苯美司的制备方法如下:

1)将L-亮氨酸苄酯对甲苯磺酸盐、HOBt、10倍(V/m)乙酸乙酯依次加入到反应釜中,投料完成不断搅拌降温,缓慢加入DCC的乙酸乙酯溶液,加入过程体系温度0-5℃之间。投料完成后体系在15-20℃间反应4h,TLC跟踪反应终点(乙酸乙酯:石油醚=2:1、紫外254nm),得到L-亮氨酸苄酯对甲苯磺酸盐的活化酯溶液;

2)将(2S,3R)-3-苄氧甲酰胺基-2-羟基-4-苯基丁酸、10倍(V/m)10%的碳酸氢钠溶液依次加入到反应釜中,搅拌至完全溶解,降温至10-15℃,快速搅拌下滴加L-亮氨酸苄酯对甲苯磺酸盐的活化酯溶液,滴加完成后在15-20℃间反应4h左右,TLC跟踪反应终点(乙酸乙酯:石油醚=2:1、紫外254nm);

3)过滤分液,水相依次用7倍、2倍(V/m)乙酸乙酯萃取,合并乙酸乙酯相,乙酸乙酯相依次用6倍0.5wt%的盐酸洗涤一次,6倍5wt%的饱和碳酸氢钠洗涤一次,6倍纯化水洗涤一次;乙酸乙酯溶液经无水硫酸钠干燥2h,过滤、浓缩至干,向浓缩物中加入5倍(V/m)石油醚,搅拌2h分散,过滤、40-45℃下干燥得N-[(2S,3R)-3-苄氧甲酰胺基-2-羟基-4-苯基丁酰]-L-亮氨酸,收率94-98%;

4)在室温下将N-[(2S,3R)-3-苄氧甲酰胺基-2-羟基-4-苯基丁酰]-L-亮氨酸、Pd/C(30%)溶解在15倍(v/m)的冰醋酸中,搅拌混合均匀后加入到反应釜中,氮气氢气依次置换三次,1.5-2MPa下搅拌反应至不吸氢为至;

5)过滤后的滤液在80℃、-0.1MPa下浓缩至干,浓缩物中加入10倍(v/m)丙酮,搅拌分散4h,过滤、40-45℃下鼓风干燥得乌苯美司醋酸盐;

6)将乌苯美司醋酸盐溶解在盐酸溶液中,溶液降温至0-5℃之间,用15wt%的氨水调节溶液pH值至5-6。0-5℃下析晶5h,过滤,固体用丙酮打浆3h,过滤,40℃下干燥得到乌苯美司成品,收率为90.5%,

主要参考资料

[1] 乌苯美司抗肿瘤作用研究进展

[2] 实用药物手册

[3] CN201710552900.0一种乌苯美司的制备方法