PLK1抗体的应用

背景^[1-3]

PLK1抗体是一种可以特异性结合PLK1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的PLK1蛋白。PLK1抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

PLK1（Polo-like Kinase 1，PLK1）以黑腹果蝇的polo基因命名，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛的存在于真核细胞中，参与有丝分裂的起始、维持和结束等进程。人源PLK1家族成员有：PLK1、PLK12、PLK13、PLK14和PLK15。其中PLK1被广泛研究。诸多研究表明，PLK1在多种癌症中高表达，是肿瘤的快速增殖所必须的，且在一些癌症中，常与较差的预后有关，推断认为PLK1作为致癌基因加快肿瘤的发生和发展。此外，最近的研究表明，PLK1可能具有其他重要功能，例如调节DNA合成、细胞凋亡、p53反式激活、DNA损伤检查点恢复和驱动肿瘤细胞转移等。因此，PLK1也被认为是治疗癌症的潜在的治疗靶点，一些靶向PLK1的抑制剂和siRNA已经用于临床试验中。

PLK1抗体

PLK1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（PLK1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(PLK1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

PLK1抗体可以用于PLK1在食管鳞状细胞癌中的表达变化及其作用机制研究

PLK1(Polo-like kinase 1)是调控中心体成熟、染色体分离和有丝分裂退出的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PLK1对于维持有丝分裂过程中基因组稳定性非常重要,在多种恶性肿瘤中发挥作用。在前期工作中发现PLK1基因所在的16p12染色体区带在食管鳞癌中存在增益,本研究旨在探讨PLK1在食管鳞癌中的表达变化及其参与该病发生发展的分子机制。我们首先采用免疫组化方法检测了PLK1在155例食管鳞癌中的表达及与肿瘤临床病理参数之间的关系,继而通过RNAi降低PLK1的表达,观察其对食管鳞癌细胞增殖、凋亡的影响,采用PLK1抗体免疫共沉淀和激光共聚焦方法确定PLK1的相互作用蛋白。

PLK1抗体结果表明,与相应的正常上皮相比,PLK1在71.6%的人食管鳞癌组织中表达明显升高。PLK1过表达与区域淋巴结转移(P=0.001)和肿瘤分期(P=0.033)密切相关。PLK1表达阳性患者的术后生存时间显著短于PLK1表达阴性的患者(P=0.001)。而且,多因素生存分析显示PLK1是一个独立的预后因素(RR=4.921,P=0.011)。通过荧光原位杂交(FISH)检测食管鳞癌中PLK1基因的扩增情况,发现37.5%的标本中包含PLK1基因的RP11-141E3位点发生了拷贝数的增加,说明基因扩增是PLK1在部分食管鳞癌组织中过表达的原因之一。通过RNA干扰降低PLK1的表达,能显著抑制食管鳞癌细胞增殖,并诱导细胞发生凋亡。PI染色和流式细胞仪检测表明,与对照组相比PLK1-RNAi组出现明显的凋亡峰,并呈时间依赖性增强。抑制PLK1表达导致线粒体膜电位降低、caspase-9和caspase-3活化、以及下游多聚ADP核糖聚合酶(PARP)降解,同时表现线粒体凋亡通路相关蛋白Mcl-1和Bcl-2蛋白水平下降。PLK1抗体免疫共沉淀和激光共聚焦分析结果显示PLK1在细胞内分别与survivin和α-catenin形成复合物。PLK1敲降导致survivin蛋白表达降低.

参考文献

[1]The Small-Molecule Inhibitor BI 2536 Reveals Novel Insights into Mitotic Roles of Polo-like Kinase 1[J].Péter Lénárt;;Mark Petronczki;;Martin Steegmaier;;Barbara Di Fiore;;Jesse J.Lipp;;Matthias Hoffmann;;Wolfgang J.Rettig;;Norbert Kraut;;Jan-Michael Peters.Current Biology,2007(4)

[2]Catenins:Keeping Cells from Getting Their Signals Crossed[J].Mirna Perez-Moreno;;Elaine Fuchs.Developmental Cell,2006(5)

[3]A Functional Interplay Between Aurora-A,Plk1 and TPX2 at Spindle Poles:Plk1 Controls Centrosomal Localization of Aurora-A and TPX2 Spindle Association[J].Maria De Luca;;Patrizia Lavia;;Giulia Guarguaglini.Cell Cycle,2006(3)

[4]ON01910,a non-ATP-competitive small molecule inhibitor of Plk1,is a potent anticancer agent[J].Kiranmai Gumireddy;;M.V.Ramana Reddy;;Stephen C.Cosenza;;R.Boomi Nathan;;Stacey J.Baker;;Nabisa Papathi;;Jiandong Jiang;;James Holland;;E.Premkumar Reddy.Cancer Cell,2005(3)

[5]冯彦斌.PLK1在食管鳞状细胞癌中的表达变化及其作用机制研究[D].中国协和医科大学,2007.