NMDAR2B抗体的应用

背景^[1-3]

NMDAR2B抗体是一种可以特异性结合NMDAR2B的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的NMDAR2B蛋白。NMDAR2B抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

NMDAR2B基因编码离子型谷氨酸受体超家族中N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体家族的一个成员。编码的蛋白质是NMDA受体离子通道的一个亚基，它是谷氨酸的激动剂结合位点。NMDA受体介导中枢神经系统兴奋性突触传递中的缓慢钙离子渗透部分。NMDA受体是由七个基因编码、不同表达的亚基组成的异源四聚体，包括NR1（GRIN1）、NR2（GRIN2A、GRIN2B、GRIN2C或GRIN2D）和NR3（GRIN3A或GRIN3B）。该基因在发育过程中的早期表达表明，它在大脑发育、回路形成、突触可塑性以及细胞迁移和分化中发挥作用。该基因的自然突变与神经发育障碍有关，包括自闭症谱系障碍、注意缺陷多动障碍、癫痫和精神分裂症。

NMDAR2B抗体

NMDAR2B抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（NMDAR2B抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(NMDAR2B抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

NMDAR2B抗体可以用于抗NMDAR2B(phospho Y1070)兔单克隆抗体制备及初步鉴定

抗体从多克隆发展到单克隆抗体药物,已被广泛应用于生物科学及医药研发技术产品中。相比鼠单克隆抗体而言,兔单克隆抗体具有高亲和力,特异性强,易于人源化等优点。n-甲基-d-天冬氨酸受体(NMDARs)是压力敏感型和配基偶联的钙离子通道,并在突触可塑性、学习记忆以及神经紊乱等方面扮演重要角色,作为一种独特的双重门控通道(doubly gated channel),它既受膜电位控制也受其它神经递质控制。该受体被激活后,主要对Ca2+有通透性,介导持续、缓慢的去极化过程。目前市面上主要是NMDAR2B的多克隆抗体,且其特异性和亲和力并不是十分理想。目的制备NMDAR2B兔单克隆抗体。

方法:本实验设计合成了一段NMDAR2B多肽,YCA-13436多肽免疫三只实验兔。经过血清blot实验初步筛选,将可能免疫了NMDAR2B兔脾细胞与240E兔骨髓瘤样细胞株融合,产生能分泌NMDAR2B抗体的兔-兔杂交瘤细胞,用HAT作为选择性培养基对融合后的细胞进行培养,运用NMDAR2B抗体ELISA法和WB法,筛选获得阳性克隆,选取其中WB信号最强的克隆进入抗体质粒重组阶段,再进一步筛选,选取分泌单克隆抗体最强的配对进入单克隆抗体大转生产。结果YCA-13436的H1332号兔子免疫效果较佳,并进入融合开发抗体,所得重组37-d抗体在多种裂解液中检出特异性目的条带,并能特异性地识别磷酸化蛋白而不能识别非磷酸化蛋白。

参考文献

[1]A phase I study of olaratumab,an anti-platelet-derived growth factor receptor alpha(PDGFRα)monoclonal antibody,in patients with advanced solid tumors[J].E.Gabriela Chiorean;;Christopher Sweeney;;Hagop Youssoufian;;Amy Qin;;Aruna Dontabhaktuni;;Nick Loizos;;Johannes Nippgen;;Robert Amato.Cancer Chemotherapy and Pharmacology,2014(3)

[2]High-Affinity Rabbit Monoclonal Antibodies Specific for Amyloid Peptides Amyloid-β40 and Amyloid-β42[J].David L.Miller;;Anna Potempska;;Jerzy Wegiel;;Pankaj D.Mehta.Journal of Alzheimer's Disease.2010

[3]Disruption of glutamate receptors at Shank-postsynaptic platform in Alzheimer's disease[J].Yuesong Gong;;Carol F.Lippa;;Jinghua Zhu;;Qishan Lin;;Andrea L.Rosso.Brain Research,2009

[4]Regulation of NMDA receptors by phosphorylation[J].Bo-Shiun Chen;;Katherine W.Roche.Neuropharmacology,2007(3)

[5]余丹.抗NMDAR2B(phospho Y1070)兔单克隆抗体制备及初步鉴定[D].浙江大学,2016.