SMUG1抗体的应用

背景^[1-3]

SMUG1抗体是一种可以特异性结合SMUG1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的SMUG1蛋白。SMUG1抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

SMUG1基因编码离子型谷氨酸受体超家族中N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体家族的一个成员。编码的蛋白质是NMDA受体离子通道的一个亚基，它是谷氨酸的激动剂结合位点。NMDA受体介导中枢神经系统兴奋性突触传递中的缓慢钙离子渗透部分。NMDA受体是由七个基因编码、不同表达的亚基组成的异源四聚体，包括NR1（GRIN1）、NR2（GRIN2A、GRIN2B、GRIN2C或GRIN2D）和NR3（GRIN3A或GRIN3B）。该基因在发育过程中的早期表达表明，它在大脑发育、回路形成、突触可塑性以及细胞迁移和分化中发挥作用。该基因的自然突变与神经发育障碍有关，包括自闭症谱系障碍、注意缺陷多动障碍、癫痫和精神分裂症。

SMUG1抗体

SMUG1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（SMUG1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(SMUG1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

SMUG1抗体可以用于SMUG1和5-FU对小鼠卵子和植入前胚胎发育作用的研究

SMUG1(Single-strand-selective monofunctional uracil DNA glycosylase 1)是单链选择性单功能尿嘧啶DNA糖基化酶1,能够引发碱基切除修复(Base Excision Repair,BER)途径,切除掺入到DNA中的尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶(5-hydroxymethyluracil,5-hmU)和5-氟尿嘧啶(5-fluoropyrimidines,5-FU)。5-FU是一种抗代谢药物,被广泛使用于肿瘤的化学治疗。

实验研究中,首先利用SMUG1抗体免疫荧光染色法检测了SMUG1在卵母细胞和早期胚胎中的定位。接着通过SMUG1-Morpholino特异性地敲低了SMUG1,并探讨了其在卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中所起的作用。最后检测了SMUG1对合子DNA去甲基化进程的影响。

SMUG1抗体结果表明,SMUG1在卵母细胞和早期胚胎的各阶段均有表达,且主要定位在细胞核中。SMUG1的敲低不会对卵母细胞的成熟进程产生影响,但会显著抑制早期胚胎的发育。此外,在1-细胞胚胎中敲低SMUG1不会影响DNA去甲基化进程。探讨了5-FU对小鼠卵母细胞、早期胚胎和卵巢的影响。在含有50μM、100μM和500μM 5-FU的培养液中培养GV期卵母细胞和早期胚胎。发现5-FU不会影响GVBD进程,但是在含500μM的培养液中GV卵的成熟率显著降低。5-FU还会抑制胚胎发育,阻碍囊胚形成。腹腔注射5-FU的小鼠,超数排卵后不能成功排出卵子,其卵巢体积明显缩小,卵巢中黄体数目减少,且无成熟卵泡形成。综上所述,SMUG1对小鼠早期胚胎发育过程具有重要的调控作用,但对受精卵中雄原核的DNA去甲基化进程没有显著作用。5-FU能够对小鼠卵母细胞和早期胚胎造成毒性,还会对卵巢的功能产生影响。

参考文献

[1]Protein Expression Landscape of Mouse Embryos during Pre-implantation Development[J].Yawei Gao;;Xiaoyu Liu;;Bin Tang;;Chong Li;;Zhaohui Kou;;Lin Li;;Wenqiang Liu;;You Wu;;Xiaochen Kou;;Jingyi Li;;Yanhong Zhao;;Jiqing Yin;;Hong Wang;;She Chen;;Lujian Liao;;Shaorong Gao.Cell Reports,2017(13)

[2]Mouse oocytes nucleoli rescue embryonic development of porcine enucleolated oocytes[J].Martin Morovic;;Frantisek Strejcek;;Shoma Nakagawa;;Rahul S.Deshmukh;;Matej Murin;;Michal Benc;;Helena Fulka;;Hirohisa Kyogoku;;Lazo Pendovski;;Josef Fulka;;Jozef Laurincik.Zygote.2017

[3]I nvestigation of chromosome X inactivation and clinical phenotypes in female carriers of DKC1 mutations[J].Jialin Xu;;Payal P.Khincha;;Neelam Giri;;Blanche P.Alter;;Sharon A.Savage;;Judy M.Y.Wong.American Journal of Hematology,2016(12)

[4]Enigmatic 5-hydroxymethyluracil:Oxidatively modified base,epigenetic mark or both?[J].Ryszard Olinski;;Marta Starczak;;Daniel Gackowski.Mutation Research-Reviews in Mutation Research.2016

[5]王璐.SMUG1和5-FU对小鼠卵子和植入前胚胎发育作用的研究[D].内蒙古大学,2019.