CBL抗体的应用

背景^[1-3]

CBL抗体是一种可以特异性结合CBL的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的CBL蛋白。CBL抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

CBL是一种E3泛素连接酶，在调节免疫反应和维持T细胞稳态方面发挥着关键作用。通过介导关键信号蛋白的泛素化和降解，CBL是T细胞活化的重要调节因子，有助于预防自身免疫。了解CBL的机制对开发新的免疫学治疗策略具有重要意义。研究人员可以利用CBL单克隆抗体在各种实验环境中研究蛋白质的表达、定位和相互作用。目前利用CBL单克隆抗体进行的研究正在扩展免疫系统调节及其对人类健康影响的知识。正在进行的CBL单克隆抗体研究将继续揭示免疫细胞信号通路的新知识。

CBL抗体

CBL抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（CBL抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(CBL抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

CBL抗体可以用于CBL诱导多发性骨髓瘤细胞迁移和干性增强的作用机制研究

利用微流控芯片分选技术筛选出与细胞骨架和细胞柔性密切相关的潜在MM药物靶标---E3泛素连接酶CBL(Casitas B-lineage lymphoma,Cbl),旨在阐明潜在药物靶点CBL增强MM细胞迁移和干性的分子机制,为MM诊疗和药物发现提供新靶标。研究方法:1.基于微流控芯片分选技术筛选柔性形变MM细胞亚群,通过CCK-8法验证分选得到的MM细胞在增殖方面有差异,通过Transwell迁移实验验证分选细胞在迁移方面差异;然后对具有增殖和迁移优势的MM细胞进行RNA-seq转录组测序筛选出差异表达基因CBL。

2. 采用慢病毒包装CBL过表达(Overexpression,OE)的质粒,并转染至MM野生型细胞株ARP1和CAG细胞,利用嘌呤霉素筛选,构建过表达CBL的MM稳转细胞株(ARP1 CBL-OE和CAGCBL-OE);通过CBL抗体WB(Western blot)实验验证稳转细胞株构建成功与否,CCK-8法和软琼脂克隆实验检测过表达细胞与野生型细胞的增殖情况,Transwell迁移实验验证CBL过表达细胞与野生型细胞在细胞迁移方面的差异,ALDH法验证过表达CBL在细胞干性方面的影响,并通过微流控芯片再验证过表达CBL细胞流出变化情况。

3. 免疫沉淀结合蛋白质谱技术(Co-IP/MS)筛选过表达CBL下调的下游靶蛋白并探究增强MM细胞迁移和干性的下游通路。利用CBL抗体WB实验、核质分离实验和免疫荧光实验验证CBL与下游蛋白的互作关系及下游通路。

4. 由于CBL是E3泛素连接酶的成员,假设CBL可能通过靶蛋白介导的泛素化影响下游通路。通过泛素化实验、CHX(50μg/mL)处理验证CBL对TJP2的泛素化降解、半衰期稳定性情况。

CBL抗体研究结果:1.微流控芯片分选技术筛选出柔性形变MM细胞亚群;CCK-8法证实分选得到的MM细胞增殖能力明显增强;Transwell迁移实验表明分选后的MM细胞迁移能力增强;对具有增殖和迁移优势的MM细胞进行RNA-seq转录组测序,筛选出与MM恶性程度密切相关的CBL基因。2.CBL抗体WB结果显示ARP1 CBL-OE、CAG CBL-OE细胞构建成功;CCK-8法和软琼脂克隆实验证实过表达CBL显著促进MM细胞增殖;Transwell迁移实验发现过表达CBL增强细胞迁移;ALDH法实验结果表明过表达CBL可以促进MM细胞干性增强,微流控芯片结果表明相较于对照细胞,过表达CBL的MM细胞在微流控芯片中的流出率明显增强,异种移植瘤动物模型实验表明过表达CBL可以促进MM体内生长。3.Co-IP/MS结果显示过表达CBL促进β-catenin入核增加,从而激活β-catenin信号通路;进一步研究分析,筛选出下游差异表达基因TJP2;WB结果表明CBL通过下调TJP2促进β-catenin入核增加而激活β-catenin通路。4.CBL抗体Co-IP实验和免疫荧光实验表明CBL与TJP2存在互作关系,并且CBL可以泛素化降解TJP2;WB结果显示过表达CBL增加泛素化降解TJP2并促进GSK3β本体磷酸化,进而降低GSK3β复合物对β-catenin的磷酸化作用,促进β-catenin表达和入核增多,进而激活β-catenin通路.

参考文献

[1]Structural Diversity of Ubiquitin E3 Ligase[J].TomaFukai Sachiko;Shimizu Toshiyuki.Molecules.2021

[2]The Oncogenic Signaling Disruptor,NDRG1:Molecular and Cellular Mechanisms of Activity[J].Chekmarev Jason;Azad Mahan Gholam;Richardson Des R..Cells.2021

[3]SLAP2 Adaptor Binding Disrupts c-CBL Autoinhibition to Activate Ubiquitin Ligase Function[J].Wybenga-Groot Leanne E.;Tench Andrea J.;Simpson Craig D.;Germain Jonathan St.;Raught Brian;Moran Michael F.;McGlade C.Jane.Journal of Molecular Biology.2021

[4]Multiple myeloma[J].van de Donk Niels W C J;Pawlyn Charlotte;Yong Kwee L.The Lancet.2021

[5]杨姝.CBL诱导多发性骨髓瘤细胞迁移和干性增强的作用机制研究[D].南京中医药大学,2022.