HEC1抗体的应用

背景^[1-3]

HEC1抗体是一种IgG2bκ小鼠单克隆Hec1抗体（也称为Hec1抗体），可通过WB、IP、IF和ELISA检测小鼠、大鼠和人类来源的Hec1蛋白。Hec1抗体（C-11）既可作为非偶联的抗Hec1抗体形式，也可作为多种偶联形式的抗Hec1抗体，包括琼脂糖、HRP、PE、FITC和多种Alexa Fluor®偶联物。在癌症中高表达（Hec1）是一种富含卷曲的蛋白质，在快速分裂细胞的S和M期大量表达，并定位于动粒。Hec1参与纺锤体检查点信号传导。Hec1在终末分化的细胞中不表达。Hec1在包括睾丸、脾脏和胸腺在内的有丝分裂率较高的组织中表达。Hec1也存在于膀胱癌细胞的晚期S至M期。在细胞分裂中，Hec1需要招募Mps1激酶和MAD1/MAD2复合物到着丝粒。Nek2对Hec1丝氨酸165的磷酸化对于忠实的染色体分离至关重要。成视网膜细胞瘤蛋白与Hec1的结合也增加了染色体分离的保真度。

HEC1抗体

HEC1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（HEC1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(HEC1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

HEC1抗体可以用于有机氯农药下调心脏Hec1表达及影响大鼠卵泡发育的分子机制研究

探究了PCNB下调心脏Hec1表达及影响卵泡发育的分子机制。我们以H9c2和HL-1心肌细胞作为实验材料,用不同浓度PCNB进行处理,HEC1抗体Western blot检测结果表明PCNB暴露显著降低Hec1蛋白表达水平。为了探究PCNB下调Hec1的分子机制,我们克隆并鉴定了Hec1的启动子区,通过Jaspar和hTF target软件预测了Hec1启动子区潜在的转录因子,结合PCNB处理组E17.5胎鼠心脏获得的差异表达基因,候选压力响应型转录因子ATF3进行后续研究。利用对照和PCNB处理组心脏组织进行Real time PCR检测,证实PCNB显著下调心脏组织ATF3的转录水平。

HEC1抗体免疫组化结果显示,ATF3在PCNB处理组的E17.5胎鼠心脏组织中表达量明显减少。用不同浓度PCNB处理H9c2和HL-1细胞后,Western blot结果显示ATF3的蛋白表达水平显著降低。这些结果与PCNB下调心脏组织和体外心肌细胞的Hec1的表达一致。为了探究ATF3与Hec1之间的调控关系,我们构建Myc-ATF3真核表达质粒,将空载体、Myc-ATF3表达质粒和Hec1启动子报告质粒分别共转染HEK293ET细胞,双荧光素酶报告基因实验检测发现ATF3能激活Hec1启动子。

将空载体和Myc-ATF3表达质粒分别转染HEK293ET和H9c2细胞,Real-time PCR检测表明ATF3过表达显著升高Hec1的mRNA水平,而特异性靶向ATF3的siRNA分别转染HEK293ET和H9c2细胞后都显著降低Hec1的mRNA水平。HEC1抗体Western blot结果显示ATF3过表达显著升高Hec1的蛋白水平,而ATF3敲低显著降低Hec1的蛋白水平。我们进一步通过Jaspar软件预测分析ATF3结合在Hec1启动子的位点,发现Hec1启动子区-26/-19位点存在ATF3可能识别的ATF/CRE元件,构建针对-26/-19区域的缺失和点突变报告质粒,进行双荧光素酶报告基因实验,结果显示-26/-19元件的缺失突变和点突变都显著降低了ATF3对Hec1启动子的转录激活作用,表明Hec1启动子区的ATF/CRE元件介导了ATF3的转录激活作用。染色质免疫沉淀实验结果显示ATF3能结合含ATF/CRE元件的区域。

参考文献

[1]ATF3 promotes the serine synthesis pathway and tumor growth under dietary serine restriction.[J].Li Xingyao;Gracilla Daniel;Cai Lun;Zhang Mingyi;Yu Xiaolin;Chen Xiaoguang;Zhang Junran;Long Xiaochun;Ding HanFei;Yan Chunhong.Cell reports.2021

[2]Chromosome oscillation promotes Aurora A-dependent Hec1 phosphorylation and mitotic fidelity.[J].Iemura Kenji;Natsume Toyoaki;Maehara Kayoko;Kanemaki Masato T;Tanaka Kozo.The Journal of cell biology.2021

[3]Environmental Risk Factors and Congenital Heart Disease:An Umbrella Review of 165 Systematic Reviews and Meta-Analyses With More Than 120 Million Participants[J].Zhang Tie Ning;Wu Qi Jun;Liu Ya Shu;Lv Jia Le;Sun Hui;Chang Qing;Liu Chun Feng;Zhao Yu Hong.Frontiers in Cardiovascular Medicine.2021

[4]The genetics of left ventricular noncompaction[J].Cannie Douglas;Elliott Perry.Current Opinion in Cardiology.2021

[5]淡清华.有机氯农药下调心脏Hec1表达及影响大鼠卵泡发育的分子机制研究[D].北京协和医学院,2022.