RAB25抗体的应用

背景^[1-3]

RAB25抗体是一种生物素偶联的非偶联IgG抗体，靶向Rab25，预测分子量为23 kDa。RAB25抗体S-可满足多种应用需求，包括包括免疫组织化学、蛋白质印迹、ELISA、免疫细胞化学和流式细胞术。RAB25是参与膜运输的小GTP酶RAS超家族的成员。RAB11亚家族的成员，包括RAB25，控制内化膜相关部分向细胞表面的转运。

RAB25抗体

RAB25抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（RAB25抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(RAB25抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

RAB25抗体可以用于Rab25与ERK在骨肉瘤中的表达及其意义

骨肉瘤(Osteosarcoma)是好发于青少年的一种恶性肿瘤，该瘤恶性程度甚高，预后极差，可于短期内转移。与其他肿瘤一样，骨肉瘤发生发展是一个多基因多阶段过程，寻找其发生发展中的关键基因并进行阻断和干预是目前的研究重点。

Rab25定位于染色体1q22，是近年来发现的Ras癌基因家族的亚家族Rab中的一员，与Rab11具有同源性,参与细胞的动力过程。既往研究发现Rab25在卵巢癌、乳腺癌组织中表达高于其他组织，认为Rab25有可能成为卵巢癌治疗的又一新途径，已有研究显示Rab25与肿瘤的发生和预后密切相关。ERK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信号转导途径中的一个重要成员，参与细胞的生长、分化、转移全过程，在多种肿瘤组织中高表达。

检测骨肉瘤及其癌旁组织中Rab25和ERK mRNA及蛋白的表达水平差异，分析两者之间关系及其对骨肉瘤发生发展的影响，为寻找骨肉瘤早期诊断和治疗的特异性靶点提供实验依据。

方法1．标本收集：骨肉瘤及其瘤旁组织均取自郑州大学第一附属医院、河南大学第一附属医院和河南大学淮河医院，所有患者均签订知情同意书。患者年龄13－26岁，其中普通型骨肉瘤18例、毛细血管扩张型骨肉瘤9例、小细胞骨肉瘤3例。癌及癌旁正常组织均经病理学诊断。2．RT-PCR(反转录聚合酶链反应)：参照《分子克隆实验指南》方法提取组织RNA，取同等量RNA依照逆转录试剂盒说明进行逆转录并扩增。3．Western blot：参照《分子克隆实验指南》方法提取组织蛋白，并进行RAB25抗体印迹实验，用DAB显色、用ECL(化学发光法)法曝光显色。4．半定量分析：蛋白和mRNA均以β-actin为内参，应用Bioimaging System成像分析系统扫描目的条带的灰度，检测骨肉瘤及其癌旁组织的Rab25和ERKmRNA和蛋白的表达水平。5．统计学处理：所获资料采用统计软件SPSS13.0软件处理，两组间的均数比较采用t检验，率的比较采用卡方检验，显著性水准取P＜0.05。

参考文献

[1]Activation of mitochondrial ERK protects cancer cells from death through inhibition of the permeability transition.[J].Rasola Andrea;;Sciacovelli Marco;;Chiara Federica;;Pantic Boris;;Brusilow William S;;Bernardi Paolo.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2010

[2]The emerging role of the RAB25 small GTPase in cancer.[J].Agarwal Roshan;;Jurisica Igor;;Mills Gordon B;;Cheng Kwai Wa.Traffic(Copenhagen,Denmark).2009

[3]ARF6-Regulated Shedding of Tumor Cell-Derived Plasma Membrane Microvesicles[J].Vandhana Muralidharan-Chari;;James Clancy;;Carolyn Plou;;Maryse Romao;;Philippe Chavrier;;Graca Raposo;;Crislyn D'Souza-Schorey.Current Biology,2009(22)

[4]Rab25 Associates withα5β1 Integrin to Promote Invasive Migration in 3D Microenvironments[J].Patrick T.Caswell;;Heather J.Spence;;Maddy Parsons;;Dominic P.White;;Katherine Clark;;Kwai Wa Cheng;;Gordon B.Mills;;Martin J.Humphries;;Anthea J.Messent;;Kurt I.Anderson;;Mary W.McCaffrey;;Bradford W.Ozanne;;Jim C.Norman.Developmental Cell,2007(4)

[5]刘志刚.Rab25与ERK在骨肉瘤中的表达及其意义[D].河南大学,2012.