大鼠白三烯C4(LTC4)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠白三烯C4(LTC4)ELISA试剂盒是一种用于体外定量检测大鼠血液、组织匀浆、细胞上清液等生物样本中白三烯C4浓度的免疫学检测工具。白三烯C4是一种重要的炎症介质，参与多种炎症和免疫反应。因此，通过检测LTC4的水平，可以对大鼠的炎症状态进行评估。

大鼠白三烯C4(LTC4)ELISA试剂盒

大鼠白三烯C4(LTC4)ELISA试剂盒包含以下组成部分：

预包被的微孔板：其中包含已被白三烯C4特异性抗体包被的孔，用于捕获样本中的白三烯C4。

样本稀释液：用于将待测样本稀释到适当的浓度。

标准品：已知浓度的白三烯C4蛋白，用于构建标准曲线，以计算样本中白三烯C4的浓度。

酶标记的抗体：特异性识别白三烯C4，并带有酶标记（如辣根过氧化物酶HRP），用于检测和放大信号。

底物溶液：在酶的作用下发生颜色变化，用以定量分析。

终止液：用于终止底物反应，通常为酸性溶液。

洗涤缓冲液：用于清洗微孔板，去除未结合的成分。

使用此试剂盒时，需按照说明书进行操作，包括加样、孵育、洗涤、显色和读板等步骤。通过比较样品的吸光度值与标准曲线，可以准确计算出样品中白三烯C4的浓度。

大鼠白三烯C4(LTC4)ELISA试剂盒操作步骤：

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

应用^[4][5]

大鼠白三烯C4(LTC4)ELISA试剂盒可以用于缺血预处理改善肝脏缺血再灌注损伤早期LTC4异常增加的分子机制

白三烯C4(LTC4)是主要经肝脏代谢的前炎症因子。研究表明,肝脏I/R损伤早期LTC4产物增加与膜脂质过氧化以及肝脏功能和形态组织损伤使LTC4代谢产物排泄减少有关,而LTC4积聚可能加重肝脏I/R导致的早已存在的炎症损伤。我们前期报道I/R早期LTC4堆积与LTC4合酶(LTC4S)表达上调和酶活性增强致LTC4合成增加有关。缺血预处理(ischemia preconditioning,IP)是指肝脏短暂缺血预适应对随后较长时间I/R损伤产生保护作用并提高其再生能力。一系列证据表明IP在与I/R损伤有关的肝移植等重大疾病中有保护作用,包括减少肝切除术中失血,降低氧化反应和过氧化物产生,稳定血流动力学及促进肝再生等。尽管有这些进展,IP减轻肝I/R机制尚未完全阐明。有关一氧化氮(nitric oxide,NO)在肝I/R中的作用已经取得一些进展。外源性的NO供体硝普钠通过保护总肝血流量有效的预防了肝损伤。IP被证明在肝切除术中通过改变NO的生成保护肝实质I/R损伤。本课题通过研究IP对肝脏I/R损伤早期LTC4含量及其合酶LTC4S的影响,并探索NO在其中的作用,进一步阐释IP调控肝脏I/R损伤早期LTC4异常增加的分子机制。为临床治疗肝移植和肝肿瘤切除等重大肝脏疾病提供新的干预靶标和手段。

方法:雄性SD大鼠随机均分为4组:假手术(sham)组,肝脏缺血再灌注(I/R)组,缺血预处理(IP)组,IP+L-NAME(L-NAME)组。采用大鼠肝脏部分(70%左右)缺血1h再灌注5h损伤模型,缺血前15min始至复灌5h经颈外静脉输注生理盐水(按3ml/kg/min)。IP组:进行长时间肝脏I/R损伤前,用无创伤动脉夹夹闭供应肝左、中叶动静脉10分钟,再松夹10分钟作为IP,余处理同I/R早期组。L-NAME组:IP前10分钟经颈静脉插管给予NOS的非特异性抑制剂L-NAME(10mg/kg),余处理同IP组。分别以RT-PCR、大鼠白三烯C4(LTC4)ELISA试剂盒、Western blotting和免疫组化法检查肝微粒体LTC4合酶(LTC4S)基因和蛋白表达,RT-HPLC检查肝组织LTC4含量及LTC4合酶活性,用血清ALT和AST评价肝功能,SOD,MDA和GSH用来评价膜脂质过氧化,HE染色检查肝组织学损伤。

结果:大鼠白三烯C4(LTC4)ELISA试剂盒结果与I/R组比较,IP组大鼠肝微粒体LTC4S基因和蛋白表达、微粒体LTC4合酶活性和组织LTC4含量明显下降(P<0.05),免疫组化染色可见LTC4S阳性较少。同时IP组伴有血清ALT、AST和肝组织MDA含量明显降低(P<0.05),SOD活性和GSH含量明显增加(P<0.05);HE染色显示IP组再灌注5h肝脏组织结构破坏较轻。但IP的这些作用在应用一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)非特异性抑制剂L-NAME后被完全反转。

参考文献

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[5]洪芬芳.缺血预处理改善肝脏缺血再灌注损伤早期LTC4异常增加的分子机制[D].南昌大学,2019.