磷酸肌酸的生产工艺

肌酸激酶（EC2.7.3.2）通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。在磷酸肌酸合成途径中起到可逆催化肌酸形成磷酸肌酸的作用，正反应过程中需要ATP提供磷酰基，磷酸肌酸含有高能键，具有储能作用，因此可以补偿机体ATP的浓度。

磷酸肌酸，在肌肉或其他可兴奋性组织（如脑和神经）中的一种高能磷酸化合物，是高能磷酸基的暂时贮存形式，其可以作为心肌细胞保护剂和能量供给物，用于临床手术和心肌缺血等辅助性治疗，效果好，安全性高，社会需求大。目前在磷酸肌酸的生产技术中，生物酶法合成技术由于其具有无环境污染，反应条件温和，反应速度快和专一性强等优点，已经成为了磷酸肌酸生产工业的研究重点。

生产工艺

生物酶法生产磷酸肌酸工艺中，技术的关键在于肌酸激酶的使用。目前，用于此酶的生产提取难以规模化，酶利用效率低等原因导致磷酸肌酸生产成本过高，因而此技术一直没有得到产业化开发，因此寻找一种催化性能高度优化的肌酸激酶尤为重要。

本发明提出一种改造肌酸激酶的方法，以使此酶更适用于磷酸肌酸工业生产的需求。它能够进一步提高酶法生产磷酸肌酸工艺中肌酸激酶的催化能力，进而提高磷酸肌酸生产效率，降低生产成本，从而为酶法生产磷酸肌酸工业化奠定基础。

本发明的技术方案为利用基因工程技术，将兔肌肌酸激酶在基因层面上对一些功能位点进行一系列的突变，以期从中筛选到性能进一步改善的肌酸激酶，如改善酶热稳定性，酶催化能力，耐碱性等，以便适用于磷酸肌酸酶法生产中的条件需求。

利用基因工程手段对肌酸激酶进行突变的详细过程为：

（1）以兔肌肉型的肌酸激酶（GeneBank:NW_003159633.1，25315-33102）为基础，对其进行一系列的突变，并人工合成突变肌酸激酶基因序列。其突变位点发生在PRO66、CYS146、TRP210、GLY268和HIS295其中一个至三个氨基酸残基上，相应替换为SER、ASN、THR和ALA其中一个至三个氨基酸残基。

（2）构建含有突变序列的克隆载体，所述克隆载体为pUC19；构建含有突变序列的表达载体，所述表达载体为pET21、pET15或pET28。

（3）转化大肠杆菌进行克隆和高效表达。所述克隆大肠杆菌为DH5α或Top10，所述表达型大肠杆菌为BL21（DE3）。

（4）将发酵菌液通过高压匀浆法等物理手段进行破碎，离心，利用乙醇沉淀法进行纯化。此步可去除80%以上的杂蛋白，且所得到的肌酸激酶依然保持高活性，可以满足酶固定化的需求，且纯化的成本亦在可接受的范围内。

本发明提供了一种可以应用于肌酸激酶酶法工业生产的酶催化剂突变改造类型，大大提高了酶催化反应效率，降低了生产成本。这些优点都为本发明改造的肌酸激酶能够广泛应用于磷酸肌酸酶法工业生产中提供了保障。

参考文献

CN104357420A