E2F2抗体的应用

背景^[1-3]

E2F2抗体是一种针对E2F转录因子家族成员E2F2的特异性抗体。E2F转录因子是一类重要的细胞周期调控蛋白，它们在细胞周期的不同阶段发挥关键作用，尤其是调控G1/S期的过渡。E2F2作为E2F家族的一员，参与了DNA复制、细胞增殖以及细胞分化等多种生物学过程。

E2F2抗体

在医学研究中有着广泛的应用，特别是在肿瘤学领域。异常的E2F2表达与多种类型的癌症相关，因此检测E2F2抗体水平可能有助于肿瘤的诊断、预后评估以及治疗反应的监测。此外，E2F2抗体也用于研究细胞周期调控、DNA损伤响应以及细胞衰老等生物学过程。

E2F2抗体是一种针对E2F2蛋白（也称为E2F Transcription Factor 2）的特异性抗体。以下是关于E2F2抗体的详细信息：

E2F2抗体特性和功能：

高度特异性：E2F2抗体能够高度特异地结合E2F2蛋白，不与其他蛋白质或抗原发生交叉反应，因此可用于准确检测和定量E2F2蛋白的存在。

多克隆性：E2F2多克隆抗体由多个不同的抗体克隆组成，提供了更广泛的识别范围，增强了对E2F2蛋白的检测敏感性。

适用性广泛：E2F2抗体适用于多种实验技术，包括免疫印迹（WB-Ce）、免疫组化（IHC-P）等，可用于不同类型的细胞和生物样本。

E2F2抗体来源：

E2F2抗体可以是兔来源的多克隆抗体，也可以是其他来源的单克隆抗体。

E2F2抗体结构：

抗体是具有4条多肽链的对称结构，包括2条重链（H链）和2条轻链（L链）。轻链有κ和λ两种，重链有μ、δ、γ、ε和α五种。

抗体分子可分为恒定区和可变区两部分，其中可变区包含了决定抗原结合特异性的高变区。

应用^[4][5]

E2F2抗体可以用于MicroRNAlet-7a在前列腺癌细胞中的表达和作用机制研究

运用体内和体外方法研究let-7a在前列腺癌中的表达情况和它对肿瘤细胞增殖的影响,并验证细胞周期相关转录因子E2F2和CCND2是否是let-7a的靶基因。

材料与方法:1.细胞培养与组织收集:人前列腺癌细胞系LNCaP、DU145、PC3及PrEC(前列腺上皮细胞)置于10%胎牛血清中培养;26例前列腺癌及周围正常组织标本来源于西京医院泌尿外科。

2.质粒的构建和转染:let-7a用miRNA分离试剂盒扩增及纯化。扩增后的产物克隆进真核表达质粒EcoRI/PstI位点,构建表达质粒pcDNA3-let-7a-GFP。将该质粒转染前列腺癌细胞系PC3并筛选后得到稳定表达let-7a的前列腺癌细胞系PC3-let-7a-GFP及空白对照PC3-GFP。同时用人工合成的let-7a mimics和空白对照(NC)或者let-7a抑制剂let-7a-inhibitor以及空白对照NC inhibitor转染PC3和LNCaP。

3.总RNA提取和实时定量反转录PCR:按试剂盒操作提取细胞和组织总RNA,用相应的引物扩增let-7a,CCND2和E2F2。

4. 细胞活性检测分析:将NC、let-7a、NC inhibitor和let-7a inhibitor转染前列腺癌细胞性PC3和LNCaP,观察5天内细胞的生长情况。与3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐孵育后将细胞溶解于二甲基亚砜中,并以490nm波长测量吸光度。

5.软琼脂克隆实验:将离散的PC3-let-7a-GFP和PC3-GFP细胞至于上层铺有0.7%软琼脂的12孔板中,18天后计数集落大于100um的分离到下层含1.2%的软琼脂中的细胞数量。

6.细胞周期分析:收集72小时后转染NC、let-7a(mimics)、NC inhibitor和let-7a inhibitor的PC3细胞和LNCaP细胞,用磷酸盐缓冲液洗涤并至于4°C酒精过夜后,重悬于500ul碘化丙啶中。流式细胞仪检测G0-G1期、S期和G2-M中的细胞含量。

7.双荧光素酶报告基因分析:用相应的引物扩增E2F2和CCND2的3’UTR,并对其与let-7a的结合位点进行点突变获得变异型的E2F2和CCND2的3’UTR。将E2F2和CCND2的3’UTR分别克隆进表达质粒pGL3中。与pRL-TK,NC、let-7a(mimics)或者pRL-TK,NC inhibitor和let-7a inhibitor共转染HEK293细胞;同时将变异型的E2F2和CCND2的3’UTR分别克隆进表达质粒pGL3中,与pRL-TK,NC、let-7a(mimics)共转染HEK293细胞。检测荧光素酶活性降低情况。

8.E2F2抗体免疫印迹分析:前列腺癌和周围正常组织蛋白以及转染let-7a和对照的细前列腺癌细胞系行蛋白电泳分离后至置于醋酸纤维膜上分离蛋白。用相应的一抗抗体孵育过夜。继而用相应FITC标记的二抗孵育并洗涤后用远红外成像系统检测E2F2、CCND2、CDK4、K-ras的蛋白含量,β-actin作为内参。

9.裸鼠荷瘤实验:各五只裸鼠皮下注射1×106的PC3-let-7a-GFP细胞或者PC3-GFP细胞,4周后处死裸鼠并观察成瘤情况。对肿瘤标本进行E2F2抗体免疫印迹分析E2F2和CCND2的蛋白表达情况。

参考文献

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[5]董青川.MicroRNAlet-7a在前列腺癌细胞中的表达和作用机制研究[D].第四军医大学,2011.