一种糠醇的制备方法

背景技术

糠醛是一种重要的生物基平台化合物(Green Chem.2010,12,539)，主要以农业废弃物如粮食作物残渣或木材废物为原料制备得到。当前，糠醛全球年产量约为28万吨(Energy Environ.Sci.2016,9,1144)。其中，我国为糠醛主要生产国，全球70％的糠醛是由我国生产的。糠醛分子中含有醛基和芳香杂环，易进一步高值化转化为各种高附加值化学品。糠醇是糠醛分子中醛基选择性还原产物，在医药、高分子、食品等领域具有重要的应用价值。据报道，约65％糠醛被用于生产糠醇。糠醇不仅可以用于合成生产优质芯模的高性能树脂、聚氨酯泡沫及聚酯等高分子材料，而且还是制备生物基燃料、四氢糠醇、抗溃疡药物雷尼替丁及香水等的重要中间体(Energy Environ.Sci.2016,9,1144；ACS SustainableChem.Eng.2015,3,1263)。

当前，工业上糠醇主要是通过糠醛催化加氢制备得到，既可以在液相体系反应得到，也可以通过气相体系来实现；无论是何种反应体系中，均以铜基催化剂为主，尤其是铜-铬催化剂最为常用(ACS Catal.2016,6,7621)。然而，铜-铬催化剂中的铬具有高毒性，因此产生了严重的环境问题。尽管近年来糠醛化学催化加氢已取得了长足的发展和进步，但仍以金属催化剂为主，并且需要高温高压，故化学法仍存在环境不友好、反应条件苛刻、选择性不佳、催化剂易失活等问题(Energy Environ.Sci.2016,9,1144)。近年来，生物催化由于具有反应条件温和、选择性高、环境友好等特点，无论是在学术界还是在工业界都受到了广泛的关注。

然而，与化学法相比，生物催化糠醛还原合成糠醇研究仍处于起步阶段，仍存在诸多问题。此外，糠醛对微生物具有强的抑制和毒性作用(Bioresour.Technol.2000,74,25)，因此全细胞催化糠醛还原仍颇具挑战。He等报道了一系列Escherichia coli基因工程重组菌，用于催化糠醛还原制备糠醇(Bioresour.Technol.2017,238,698；Bioresour.Technol.2017,245,841；Appl.Biochem.Biotechnol.2018,185,42；Bioresour.Technol.2018,262,52)。这些工程菌对糠醛的最高耐受度约为200mM，当反应体系中糠醛浓度超过该值时，糠醇的产率急剧下降。尽管重组菌E.coli CCZU-K14能较高效、高选择性地催化200mM糠醛转化为糠醇，但是该生物转化需要添加过量的辅底物(300mM葡萄糖)及辅酶前提物(400mM木糖)方能顺利进行，这不仅大大限制了该工艺的经济性和实用性，而且加大了后续产物分离纯化的难度(Bioresour.Technol.2017,238,698)。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种高活性、高底物耐受性、易重复利用的固定化生物催化剂；并基于该固定化生物催化剂，提供一种简单、高效、且高选择性合成糠醇的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种糠醇的制备方法，将固定化季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)SC1103用于催化糠醛还原制备糠醇。

所述的制备方法，包括如下步骤：将固定化季也蒙毕赤酵母SC1103细胞加入含有糠醛和葡萄糖的缓冲液中，进行反应，得到糠醇。

优选地，所述固定化季也蒙毕赤酵母SC1103细胞浓度为20～60mg(细胞湿重)/mL缓冲液。

优选地，所述糠醛浓度为50～250mM。

优选地，所述固定化季也蒙毕赤酵母SC1103细胞浓度为30～60mg(细胞湿重)/mL缓冲液，所述糠醛浓度为50～200mM。

优选地，所述葡萄糖与糠醛的摩尔比为7:15～1:1。

优选地，所述缓冲液为乙酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液的pH介于5～9。

优选地，所述反应条件为：温度为25～45℃，时间为2～24h，搅拌速度为200r/min。

优选地，所述固定化季也蒙毕赤酵母SC1103的制备方法为：将收集的固定化季也蒙毕赤酵母SC1103细胞按200～600mg/mL(细胞湿重)的浓度与海藻酸钠溶液混合均匀；然后，用无菌注射器逐滴滴入CaCl2溶液中静置固化，最后用Tris-HCl缓冲液洗涤即可。

优选地，所述季也蒙毕赤酵母SC1103经过浓度梯度驯化，所述驯化方法为：将季也蒙毕赤酵母SC1103菌种接入含5mM 5-羟甲基糠醛的液体培养基中，于30℃、200r/min下培养12h后，以2％的接种量将该菌悬液接入新鲜的含5mM 5-羟甲基糠醛的液体培养基中，30℃、200r/min下培养12h；随后，以2％的接种量将上述菌悬液先后接入含10及15mM 5-羟甲基糠醛的液体培养基中，分别进行驯化；驯化后的菌株保藏于马铃薯葡萄糖琼脂斜面；所述液体培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖，其组成为1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖。

所述酵母活化方法为：将驯化后的季也蒙毕赤酵母SC1103菌种接入酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，于30℃、200r/min下培养12h后，以2％的接种量将该菌悬液接入新鲜酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，30℃、200r/min下培养12h，收集菌体细胞。

本发明与现有的技术相比，具有如下的优点：

1)利用固定化细胞作为催化剂，不仅能克服了化学催化剂环境不友好的缺点，而且在反应结束后可以通过简单的过滤回收生物催化剂，既可实现催化剂的重复利用，又易于产物的分离纯化。

2)本发明的固定化生物催化剂对底物具有高耐受性，能高效、高选择性催化高浓度底物还原合成目标产物，产物时空收率高。

3)本发明反应过程简单，易控、条件温和，活泼的糠醛在反应过程中不易发生副反应，不仅提高产品品质高、降低了能耗，而且有利于简化后续目标产物的分离纯化工艺。

本发明所用季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)SC1103，于2016年3月31日，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号：CCTCC NO.M 2016144，该菌株已在公开号为CN106520580A的专利中公开，属于现有技术。

具体实施方式

通过实施例进一步说明本发明，但不局限于实施例。

季也蒙毕赤酵母SC1103驯化与活化：季也蒙毕赤酵母SC1103菌种接入含5mM HMF的酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)液体培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨及2％葡萄糖)中，于30℃、200r/min下培养12h后，以2％的接种量将上述菌悬液接入新鲜的含5mM HMF的YPD液体培养基中，30℃、200r/min下培养12h。随后，以2％的接种量将上述菌悬液先后接入含10及15mM5-羟甲基糠醛的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，采用类似的步骤分别进行驯化。将上述驯化后的季也蒙毕赤酵母SC1103菌种接入YPD液体培养基中，于30℃、200r/min下培养12h后，以2％的接种量将上述菌悬液接入新鲜YPD液体培养基中，30℃、200r/min下培养12h，收集菌体细胞。