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热稳定无机焦磷酸酶的制备

发布日期:2019/4/17 17:41:28

背景及概述[1]

在生物体内,NTPs/dNTPs参与核酸的生物合成会生成副产物焦磷酸盐,体内存在的焦磷酸盐会在焦磷酸酶的催化作用下分解,减少焦磷酸累积可能造成的负面效应。PCR利用嗜热酶模拟体内核酸复制的体外反应,伴随dNTPs的参入,焦磷酸的累积同样会降低PCR扩增的效率。焦磷酸的积累,会导致反应混合物的pH降低,影响荧光染料的稳定性。

为了去除这些焦磷酸对PCR的抑制,人们在PCR反应中添加无机焦磷酸酶,用以将焦磷酸(PPi)会水解为正磷酸(Pi)。这种反应,会使反应混合液的pH增加,并是的荧光染料变得更稳定。为了适应PCR的高温,这种焦磷酸酶必须能耐受95℃的高温。重组表达了超嗜热古菌(Pyrococcushorikoshii)的PPase基因,这种酶最适温度为88℃,最适pH为10.3,并不适合PCR的使用。重组表达了嗜热栖热菌(Thermusthermophiles)HB27株的PPase基因。由此,基于嗜热栖热菌的PPase基因,构建一种改造的热稳定无机焦磷酸酶,这种酶可以应用于需要更多循环数以及反应时间的超敏PCR扩增,增加反应的扩增效率。热稳定无机焦磷酸酶特点:1)增强DNA复制2)100℃加热4小时,酶仍具有100%活性。热稳定无机焦磷酸酶来自重组E.coli菌株,携带从极度耐热的Thermococuslitoralis中克隆的无机焦磷酸酶基因。

制备[1]

热稳定无机焦磷酸酶,其序列为:

MANLKTLPVGEKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGLVLSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIADVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRAAALEEVKACIARYGK(SEQIDNO:1)。

将上述酶的位点进行改造,改造位点及改造方法如下:将原酶的序列的第6位氨基酸T改造为氨基酸S;第11位氨基酸E改为氨基酸K;第72位氨基酸L改为氨基酸I或者第73位氨基酸V改为氨基酸I;第124位氨基酸D改造为氨基酸A;第160位氨基酸A改造为Q或K。获得两条氨基酸序列如下的热稳定焦磷酸酶:

无机焦磷酸酶1:

MANLKSLPVGKKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGIVLSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIAAVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRQAALEEVKACIARYGK(SEQIDNO:2)。

无机焦磷酸酶2

MANLKTLPVGEKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGLILSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIAAVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRKAALEEVKACIARYGK(SEQIDNO:3)。

按照上述焦磷酸酶的氨基酸序列人工合成对应的碱基序列,扩增构建表达载体,表达蛋白并进行纯化。

主要参考资料

[1] CN201710017276.4 一种改造的热稳定无机焦磷酸酶