淀粉脱脂酶的应用

背景及概述^[1]

淀粉脱脂酶[Glucoamylase，(EC.3.2.1.3.)]又称糖化酶，它能把淀粉从非还原性未端水解α‑1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α‑1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，糖原的非还原木端释放β‑D‑葡萄糖。应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量应用范围最广的酶类。当前市场上的淀粉脱脂酶产品是来源于天然菌株生产淀粉脱脂酶。但是，由于当前的酶产品是来源于单种酶基因编码，适合反应温度范围和适合反应pH范围窄，不能满足不同用途对于酶的多种适合反应温度和适合反应pH范围的需求。由于淀粉脱脂酶有多种来源，那么，不同来源的淀粉脱脂酶的基因序列可不相同，不同来源的淀粉脱脂酶的理化特性可不相同。毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)都是常用于生产重组蛋白的宿主菌，但各具有特征。毕赤酵母的主要特征是分泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化的特点，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母具有兼性需氧的特性，适合于固态厌氧发酵生产重组酶。

应用^[2-4]

淀粉脱脂酶（Glucoamylase，EC3.2.1.3），是水解淀粉的外切作用糖酶。它能把淀粉从非还原性未端水解α-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，从糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。

1)利用淀粉脱脂酶制备人参浆的方法，该方法包括：取人参加入纯净水；用料理机或粉碎机绞碎，然后使用胶体磨充分精磨人参浆，并使用柠檬酸或乳酸中的一种或两种调整pH值，使用高温高压方法处理人参浆，温度105~115℃，时间10~15分钟；将熟化的人参浆放入酶解罐，按照330.0~350.0克/吨的添加量添加α-淀粉酶，作用1小时；经α-淀粉酶酶解后，再按照7.0~7.5毫升/吨的添加量添加淀粉脱脂酶，水解1小时；水解后人参浆于100℃条件下，进行灭酶处理15~30分钟，得到充分糖化的人参浆。本发明在α-淀粉酶酶解人参浆后，再应用淀粉脱脂酶进行酶解，充分利用了人参中的有效成分，得到的产品了应用于诸多领域，生产工艺简单，适宜大规模的工业化生产。

2)一种非水溶性杏仁膳食纤维粉，主要包括杏仁渣、软水、中性脂肪酶、水、淀粉脱脂酶和中性蛋白酶，制备方法：(1)取杏仁渣，加软水，搅拌过滤，收集滤渣再次处理3~4次，软水洗涤；(2)向杏仁渣中加软水，加中性脂肪酶，过滤，收集滤渣，即为脱脂肪杏仁渣；(3)向脱脂肪杏仁渣中加水，加进淀粉脱脂酶，过滤，收集滤渣、即为脱脂肪、脱淀粉杏仁渣；(4)向脱脂肪、脱淀粉杏仁渣中加水，加中性蛋白酶，过滤，用软水洗涤，收集滤渣，即为非水溶性杏仁膳食纤维粉。本发明保护物质内部的结构，从而提高预防结肠癌、肠憩室症、便秘、肥胖及胆结石的作用。

制备^[4]

构建含曲霉的淀粉脱脂酶基因表达框架、毛壳菌的淀粉脱脂酶基因表达框架和酵母的淀粉脱脂酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌，生产重组混合淀粉脱脂酶。技术方案是：

1.克隆酶基因：应用分子生物学技术，分别从曲霉基因组、毛壳菌基因组和酵母基因组中扩增淀粉脱脂酶基因。

2.获得应用于表达载体构建所需的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子和抗性基因。

3.构建含曲霉的淀粉脱脂酶基因表达框架、毛壳菌的淀粉脱脂酶基因表达框架和酵母的淀粉脱脂酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体。

4.将含曲霉的淀粉脱脂酶基因表达框架、毛壳菌的淀粉脱脂酶基因表达框架和酵母的淀粉脱脂酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母；将含曲霉的淀粉脱脂酶基因表达框架、毛壳菌的淀粉脱脂酶基因表达框架和酵母的淀粉脱脂酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母；将含曲霉的淀粉脱脂酶基因表达框架、毛壳菌的淀粉脱脂酶基因表达框架和酵母的淀粉脱脂酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌。

5.分别筛选高表达曲霉的淀粉脱脂酶基因编码的淀粉脱脂酶、毛壳菌的淀粉脱脂酶基因编码的淀粉脱脂酶和酵母的淀粉脱脂酶基因编码的葡萄糖淀粉的毕赤酵母重组子作为含曲霉的淀粉脱脂酶基因表达框架、毛壳菌的淀粉脱脂酶基因表达框架和酵母的淀粉脱脂酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌；筛选高表达含曲霉的淀粉脱脂酶基因表达框架、毛壳菌的淀粉脱脂酶基因表达框架和酵母的淀粉脱脂酶基因表达框架的酿酒酵母重组子作为含曲霉的淀粉脱脂酶基因表达框架、毛壳菌的淀粉脱脂酶基因表达框架和酵母的淀粉脱脂酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌；筛选高表达含曲霉的淀粉脱脂酶基因表达框架、毛壳菌的淀粉脱脂酶基因表达框架和酵母的淀粉脱脂酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌重组子作为含曲霉的淀粉脱脂酶基因表达框架、毛壳菌的淀粉脱脂酶基因表达框架和酵母的淀粉脱脂酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌。

6.发酵含曲霉的淀粉脱脂酶基因表达框架、毛壳菌的淀粉脱脂酶基因表达框架和酵母的淀粉脱脂酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合淀粉脱脂酶。

主要参考资料

[1] CN201310718737.2一种淀粉脱脂酶

[2] CN201310355887.1一种利用淀粉脱脂酶制备人参浆的方法

[3] CN201310735376.2一种非水溶性杏仁膳食纤维粉及其制备方法

[4] CN201210251820.9一种生产淀粉脱脂酶的方法