HUH-28 人胆管癌细胞系的应用

背景^[1-3]

HUH-28人胆管癌细胞系是一种来源于人胆管癌的细胞系，被广泛用于研究胆管癌的发生、发展和治疗。该细胞系具有高度的恶性程度和侵袭性，能够快速生长并形成肿瘤。

HUH-28人胆管癌细胞系的主要特点是：

高度恶性：HUH-28人胆管癌细胞系具有高度的恶性程度，能够在体外快速生长并形成肿瘤。

侵袭性：HUH-28人胆管癌细胞系具有较强的侵袭性，能够穿过基底膜并进入周围组织。

易转移：HUH-28人胆管癌细胞系容易发生转移，可以通过血液或淋巴系统扩散到其他部位。

可重复性好：HUH-28人胆管癌细胞系的生长和转移过程可以重复多次，且结果稳定可靠。

HUH-28人胆管癌细胞系广泛应用于肿瘤学研究中，包括肿瘤发生机制的研究、抗肿瘤药物的筛选和评价、肿瘤免疫治疗的研究等。

HUH-28人胆管癌细胞系

HUH-28人胆管癌细胞系细胞培养操作

1)复苏HUH-28人胆管癌细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)HUH-28人胆管癌细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)HUH-28人胆管癌细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

HUH-28人胆管癌细胞系可以用于CXCL7促进胆管癌细胞的增殖和侵袭

少CXCL7表达抑制胆管癌细胞的增殖和侵袭性1.细胞培养人胆管癌细胞系(HuCCT1、HUH-28人胆管癌细胞系、QBC939、EGI-1、OZ和WITT)和人肝星状细胞系LX-1从中国科学院上海细胞库购买。所有细胞都在添加了10%胎牛血清(美国Gibco)的DMEM培养基(美国Gibco)中,在5%C02、37℃培养箱中培养。

2. 细胞转染根据生产商指示,使用脂质体2000进行细胞转染。简单地说,细胞HUH-28人胆管癌细胞系培养生长至70%融合时在无血清的DMEM培养液中重悬。用无血清培养基分别稀释空白pcDNA3,1载体、pcDNA3.1-CXCL7质粒、非特异性siRNA、CXCL7 siRNA和脂质体2000。然后将稀释的脂质体2000加入稀释质粒或siRNA中,在室温孵育20分钟,然后加入细胞悬液。在37℃孵育6小时后,将培养基替换为正常含血清培养基。然后,在进行以下检测前培养细胞48小时。

3. RT-PCR分析使用Trizol试剂(美国Life Technologies公司)按照制造商的说明提取HUH-28人胆管癌细胞系总RNA。使用反向转录试剂盒(美国Life Technologies公司)根据制造商的说明将800ng RNA转换成cDNA。然后使用荧光定量PCR检测试剂盒在ABI7500热循环仪上进行实时荧光定量PCR(美国Life Technologies公司)。PCR步骤:95℃10分钟,95℃变性15秒,60℃退火/延伸60秒,反应40个循环,GAPDH作为内参。用2-△△Ct法分析相对表达量。

4. 免疫印迹试验用冰冷的裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl,pH=6.8,100mM 2-ME,2%w/v SDS,10%的甘油)裂解HUH-28人胆管癌细胞系细胞。蛋白质用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,然后转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF,美国Life Technologies公司)上。将PVDF膜与含有5%牛奶的PBS在4℃下过夜孵育。将膜用PBS清洗3次后,在室温下与第一抗原(Abcam公司、美国马萨诸塞州剑桥市)室温孵育3h。然后,将PVDF膜用PBS再清洗3次,并与第二抗体(Abcam公司)在室温下孵育1h。然后用Super Signal West Pico化学发光底物试剂盒(Pierce公司,美国伊利诺伊州罗克福德市)根据制造商的说明检测信号。用Image-Pro plus 6.0版软件进行蛋白相对表达量分析,检测值以与GAPDH的密度比表示。

5. 酶联免疫吸附试验(ELISA)将含10%胎牛血清的DMEM培养基中的HUH-28人胆管癌细胞系细胞接种至6孔板(接种密度1.5×105细胞/孔)并培养48小时。然后,收集上清液在12000xg离心10分钟。使用人CXCL7 ELISA试剂盒按照制造商的说明检测CXCL7的分泌水平(Thermo Fisher公司,美国)。

6. MTT试验MTT试验用于检测HUH-28人胆管癌细胞系细胞增殖。简单地说,将细胞按每孔10000个细胞的密度接种于96孔板。经过0、24、48和72小时培养后,将细胞同终浓度为0.5mg/ml的MTT在37℃孵育4小时。去除培养基,增入150mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液。使用生物TekTM ELX 800TM吸光度酶标仪在570nm波长处读取吸光度。

7. Transwell试验用Transwell小室(美国BD公司)进行Transwell试验,检测HUH-28人胆管癌细胞系细胞侵袭性。在无血清培养基中制备密度为5×105细胞/ml的细胞悬液,取300μl细胞悬液加到上室。然后,将500μl含10%胎牛血清的DMEM加入下室。将细胞孵育24h。然后,我们用棉签仔细擦出未迁移出孔的细胞。将过滤板在90%的酒精中固定并用苏木素染色,在倒置显微镜(奥林巴斯公司,日本东京)下观察。

参考文献

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[3]CXCL12/SDF-1αActivates NF-κB and Promotes Oral Cancer Invasion through the Carma3/Bcl10/Malt1 Complex[J].Aasia O.Rehman.International Journal of Oral Science,2009(03)

[4]Genetic and epigenetic changes associated with cholangiocarcinoma:From DNA methylation to microRNAs[J].Monique Stutes;Steven Tran;Sharon DeMorrow.World Journal of Gastroenterology,2007(48)

[5]郭茜.CXCL7促进胆管癌细胞的增殖和侵袭[D].南方医科大学,2020.