NCI-H69人小细胞肺癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

NCI-H69人小细胞肺癌贴壁细胞系源自一位54岁患有小细胞肺癌的白人男性，表达c-myb,v-fes,v-fms,c-raf1,Ha-ras,Ki-rasandN-rasmRNA。通过STR鉴定结果无误，其鉴定结果如下：Amelogenin：X，Y；CSF1PO：10，12，13；D13S317：12；D16S539：11；D18S51：12，15；D19S433：15，15.2；D21S11：30，31.2；D2S1338：17；D3S1358：16；D5S818：11，13；D7S820：9；D8S1179：13；FGA：24；TH01：8，9；TPOX：10；vWA：16，17。

NCI-H69人小细胞肺癌贴壁细胞系

冻存NCI-H69人小细胞肺癌贴壁细胞系细胞的复苏

①将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4~6mL完全培养基的离心管中混合均匀，1000rpm/min离心3~5min，弃去上清液。加入1mL完全培养基重悬细胞后，均匀铺于含6~8mL完全培养基的培养瓶（或皿）中，置于37℃恒温细胞培养箱中过夜培养。第二天显微镜下观察细胞生长情况。

②NCI-H69人小细胞肺癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。

注意：建议复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩，避免冻存管处于温差较大情况下发生爆炸造成人员伤害。

（二）该NCI-H69人小细胞肺癌贴壁细胞系传代可以参考以下方法：

①收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。

②加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

③将收集到的悬浮细胞、pbs清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

（三）NCI-H69人小细胞肺癌贴壁细胞系细胞冻存

①细胞冻存时，步骤同细胞传代的①~④，细胞计数后，加入配制好的细胞冻存液，重悬细胞，按照1×106~1×107个细胞/mL分配到一个冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

②将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

应用^[4][5]

NCI-H69人小细胞肺癌贴壁细胞系可以用于Bcl-2反义寡核苷酸对人小细胞肺癌NCI-H69化疗敏感性的影响

研究Bcl-2反义寡核苷酸对人小细胞肺癌细胞NCI-H69化疗药物敏感性的促进作用。

方法:将NCI-H69细胞培养传代,细胞共分4组,反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组和空白对照组,通过脂质体将不同寡核苷酸导人细胞中,Western-Blot法检测Bcl-2蛋白的表达。化疗药物依托泊甙(vp-16)分别以不同浓度加入4组细胞。流式细胞仪的检测细胞凋亡率,MTT法测定细胞存活分数。

结果:4组细胞中,与空白对照组相比较,反义寡核苷酸组的Bcl-2蛋白表达明显受到抑制,而正义寡核苷酸组和无义寡核苷酸组细胞的Bcl-2蛋白表达则与空白对照组差别不明显。细胞中加入vp-16后,反义寡核苷酸组细胞在Vp-16浓度0.25、0.5、1.0、2.0、4.0ug/ml的凋亡率明显高于空白对照组,统计结果差异具有显著性(P<0.05),正义寡核苷酸组和无义寡核苷酸组与空白对照组相比则无统计学差异。四组细胞接受vp-16后,转染反义寡核苷酸组在不加人Vp-16和加入vp-16不同剂量后的存活分数均低于空白组,且有统计学差异(P<0.01),而转染正义链和无义链组与空白组比较则无统计学差异。

结论:Bcl-2反义寡核苷酸能有效封闭Bcl-2基因的表达,增强小细胞肺癌细胞NCI-H69对化疗药物的敏感性。

参考文献

[1]Apoptotic signaling cascades.Paula C.Ashe;;Mark D.Berry.Progress in Neuropsychopharmacology&Biological Psychiatry,2003

[2]The Bcl-2 protein family:sensors and checkpoints for life-or-death decisions.Christoph Borner.Molecular Immunology,2003

[3]X-irradiation enhances the expression of Bcl-2 in HL-60 cells:the resultingeffects on apoptosis and radiosensitivity..S Kariya;;Y Ogawa;;S Yoshida;;M Yabuki;;Y Imajo;;K Utsumi.International Journal of Molecular Medicine,1999

[4]bcl-2 immunoreactivity but not p53 accumulation associated with tumour response to radiotherapy in cervical carcinoma.M.Radhakrishana Pillai;;P.G.Jayaprakash;;M.Krishnan Nair.Journal of Cancer Research and Clinical Oncology,1999

[5]张彦.Bcl-2反义寡核苷酸对人小细胞肺癌细胞NCI-H69放射敏感性的影响[D].青岛大学,2005.