人肺癌细胞的应用

背景^[1-3]

人肺癌细胞该细胞系是1972年由Giard DJ通过肺癌组织移植培养建系的，源自一位58岁的白人男性。人肺癌细胞A549能通过胞苷二磷脂酰胆碱途径合成富含不饱和脂肪酸的卵磷脂；角蛋白阳性。1:3~1：8传代；每周2~3次。

人肺癌细胞

人肺癌细胞复苏、传代及冻存流程参考：

1、人肺癌细胞复苏

1）配制完全培养基：基础培养基+胎牛血清+双抗（特殊培养基特殊配置）；

2）人肺癌细胞复苏：取5ml完全培养基于15ml离心管中，37℃水浴锅预热，从液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅中，摇晃使快速化冻（1min左右），然后将化冻的细胞和预热的培养基，移入超净工作台中，化冻的细胞加入到含预热培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）吸弃上清，得到细胞沉淀，用2ml完全培养基轻轻重悬细胞，加入到T25培养瓶中，做好标记，放入37℃，5%CO2饱和适度培养箱中培养（培养皿复苏效果更好）；

4）24h后，观察细胞贴壁情况（未贴壁的即为死细胞--针对贴壁细胞），吸弃旧培养基，加入新鲜的预热（室温或37℃）的完全培养基，继续培养。

2、人肺癌细胞传代

1）待人肺癌细胞生长到80%-90%汇合度时，吸弃旧的培养基，加入1ml无菌PBS润洗一次，以去除残余的培养基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培养箱中消化（1~2min左右，不同细胞消化时间不同），取出细胞，镜下观察细胞至细胞皱缩变圆；

2）加入1ml完全培养基（含FBS）终止消化，轻轻拍打，使细胞脱落下来成单个细胞悬液，收集细胞于15ml无菌离心管中，1000rpm，离心5min；

3）收集人肺癌细胞沉淀，完全培养基重悬，一分为二（可根据细胞生长速度调整比例），分别加入到2个新的培养瓶中，做好标记，放入培养箱中培养。

3、人肺癌细胞冻存

1）按照人肺癌细胞传代方法，在超净工作台内消化收集细胞沉淀，取少量细胞用于计数；

2）用预冷的1ml冻存液（90%完全培养基+10%DMSO）或者无血清细胞冻存液重悬细胞，加入到1.2ml冻存管中，密度为1*106个/ml。

3）放入程序冻存盒，-80℃过夜后，转入液氮长期保存。

应用^[4][5]

人肺癌细胞可以用于大豆苷元诱导肺癌A549细胞凋亡及其相关机制的研究

通过研究DAI对3种肺癌细胞的杀伤效应以及3种正常细胞的毒副作用,利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法进行了检测;采用荧光显微镜观察法和流式细胞术(FCM)对DAI的诱导凋亡进行检测;通过FCM对DAI在肺癌细胞内的周期阻滞作用进行检测;通过FCM对DAI在肺癌细胞内活性氧(ROS)水平的调控作用进行检测;通过细胞划痕实验对DAI在肺癌细胞的抑制迁移作用进行检测;通过蛋白质免疫印迹法(western blot)对细胞凋亡、ROS水平、周期阻滞、迁移抑制以及相关信号通路蛋白表达量情况进行检测。

结果显示,与阳性对照5-FU组相比,DAI对3种肺癌细胞具有杀伤作用,且对3种正常细胞表现出的毒副作用并不显著;随着DAI处理A549细胞时间的不断增加,细胞出现明显的皱缩变圆的凋亡形态、早晚期凋亡数量的总和不断增加并显著降低了A549细胞内线粒体膜电位,此外,DAI还能够显著降低凋亡相关蛋白Bcl-2/Bad的比例,释放细胞色素C(Cytochrome C,cyto-c),介导caspase-3和PARP被活化,最终使细胞发生线粒体依赖性凋亡;DAI可通过促进周期蛋白p21、p27的表达,抑制周期蛋白p-AKT、CDK2/4/6和cyclin D1/E的表达,使细胞在G0/G1期发生周期阻滞;DAI能够上调肺癌A549细胞中ROS水平,进而激活JNK、p38信号通路,抑制ERK,STAT3和NF-κB信号通路,使A549细胞发生凋亡;DAI在处理A549细胞后,其迁移作用明显地受到了抑制,且呈时间依赖性,并通过TGF-β信号通路有效抑制肺癌A549细胞发生迁移。

综合以上结果,DAI对3种肺癌细胞具有杀伤作用,且能够使肺癌A549细胞内ROS水平升高,进而调控MAPK,STAT3和NF-κB信号通路,使肺癌A549细胞发生线粒体依赖性凋亡和细胞周期阻滞,并通过调控TGF-β信号通路抑制细胞迁移和侵袭。本研究为研制出一种安全有效的防治肿瘤功能因子提供新的思路和理论依据。

参考文献

[1]Hyperoside Induces Breast Cancer Cells Apoptosis via ROS-Mediated NF-κB Signaling Pathway[J].Jinxia Qiu;;Tao Zhang;;Xinying Zhu;;Chao Yang;;Yaxing Wang;;Ning Zhou;;Bingxin Ju;;Tianhong Zhou;;Ganzhen Deng;;Changwei Qiu.International Journal of Molecular Sciences,2019(1)

[2]Hispolon induces apoptosis against prostate DU145 cancer cells via modulation of mitochondrial and STAT3 pathways.[J].Masood Muqaddas;;Rasul Azhar;;Sarfraz Iqra;;Jabeen Faiza;;Liu Sitong;;Liu Xintong;;Wei Wei;;Li Jiang;;Li Xiaomeng.Pakistan journal of pharmaceutical sciences,2019(5(Su)

[3]Expression pattern of estrogen receptorβand its correlation with multidrug resistance in non-small cell lung cancer.[J].Huang L;;Liu T;;Ji H;;Yang S;;Sui J;;Yang W S;;Liang G Y;;Zhang X M.Neoplasma,2019(5)

[4]Sex and survival in non-small cell lung cancer:A nationwide cohort study.[J].Cecilia Radkiewicz;;Paul William Dickman;;Anna Louise Viktoria Johansson;;Gunnar Wagenius;;Gustaf Edgren;;Mats Lambe.PLoS ONE,2019(6)

[5]翟雨晴.大豆苷元诱导肺癌A549细胞凋亡及其相关机制的研究[D].黑龙江八一农垦大学,2021.