人喉表皮样癌的应用

背景^[1-3]

人喉表皮样癌细胞源自喉上皮癌，但随后通过同功酶分析、HeLa标记染色体和DNA指纹分析发现，HEp-2细胞的起源是HeLa细胞污染的。HEp-2细胞角蛋白免疫过氧化物酶染色阳性。(STR检测位点同HELA)。

人喉表皮样癌细胞

人喉表皮样癌细胞培养步骤：

一、复苏人喉表皮样癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

二、人喉表皮样癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a）、对于贴壁人喉表皮样癌细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若人喉表皮样癌细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打人喉表皮样癌细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将人喉表皮样癌细胞悬液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

三、人喉表皮样癌细胞冻存：

1、人喉表皮样癌细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗人喉表皮样癌细胞一次；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待人喉表皮样癌细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3、用适量的冻存液重悬人喉表皮样癌细胞，并放置于冻存管中；

4、先将细胞冻存管放置于-20℃1.5h，然后将其移入-80℃

应用^[4][5]

人喉表皮样癌细胞可以用于miR-362-3p在喉癌中表达和影响喉癌细胞迁移作用机制的初步研究

运用相关分子生物学技术检测miR-362-3p在喉癌中表达水平、临床意义及其对喉癌细胞迁移侵袭能力的影响,预测miR-362-3p的潜在靶基因ALDOA,研究其是否通过ALDOA参与喉癌细胞的迁移侵袭,为寻找喉癌早期诊断和预后判断生物标志物提供线索。

实验材料1、细胞系:人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系、人胚肾HEK293细胞、人咽鳞癌细胞系FADU、人喉癌细胞TU212。

2、组织标本:收集2015年1月至2017年11月新鲜喉癌及相应癌旁正常组织标本50例,术后立即将组织置-80℃冰箱保存。所有组织标本均经病理医生证实,并获得患者相关临床资料信息。经中国医科大学医学伦理委员会批准,并获得患者知情同意。

实验方法：1、细胞培养；2、基因瞬时转染实验；3、qRT-PCR检测；4、Western blot检测；5、细胞划痕实验；6、Transwell小室检测法；7、临床资料分析；8、统计分析。

实验结果:1、qRT-PCR结果显示,miR-362-3p在喉癌组织中的表达水平较癌旁组织显著升高(P<0.05);同时,miR-362-3p在喉癌Hep2细胞中的表达水平较HEK293细胞显著升高(P<0.05)。提示miR-362-3p在喉癌中可能发挥癌基因作用。

2、单因素方差分析结果显示,与对照组相比,miR-362-3p在淋巴结转移和较高级别临床分期的喉癌患者癌组织中表达水平显著上调(P<0.05),而在不同年龄、性别、分化程度和浸润深度癌组织中表达水平无显著差异(P>0.05),提示miR-362-3p与喉癌的恶性程度有关。

3、qRT-PCR结果显示,miR-362-3p在转染miR-362-3p mimic或miR-362-3p inhibitor的Hep2细胞中表达水平较对照组(nc)分别显著升高或降低(P<0.05),证明转染成功。Transwell小室检测和细胞划痕实验结果表明,miR-362-3p mimic转染组中Hep2细胞迁移数量和迁移距离较对照组(nc)显著增加(P<0.05),miR-362-3p inhibitor转染组中Hep2细胞迁移数量和迁移距离较对照组(nc)显著减少(P<0.05),提示miR-362-3p促进Hep2细胞迁移。

参考文献

[1]Antiproliferative potential of miR‐33a in laryngeal cancer Hep‐2 cells via targeting PIM1[J].Omer Faruk Karatas PhD.Head&Neck,2018(11)

[2]Long noncoding RNA CASC2 regulates hepatocellular carcinoma cell oncogenesis through miR‐362‐5p/Nf‐κB axis[J].Liang Zhao;;Yongjian Zhang;;Yubao Zhang.Journal of Cellular Physiology,2018(10)

[3]Aldolase A as a prognostic factor and mediator of progression via inducing epithelial–mesenchymal transition in gastric cancer[J].Zhonghua Jiang;;Xiaohong Wang;;Jing Li;;Hongmei Yang;;Xin Lin.Journal of Cellular and Molecular Medicine,2018(9)

[4]Roles of Aldolase Family Genes in Human Cancers and Diseases[J].Yu-Chan Chang;;Yi-Chieh Yang;;Chia-Ping Tien;;Chih-Jen Yang;;Michael Hsiao.Trends in Endocrinology&Metabolism,2018

[5]赵越.miR-362-3p在喉癌中表达和影响喉癌细胞迁移作用机制的初步研究[D].中国医科大学,2019.