人皮肤黑色素瘤细胞的应用

背景^[1-3]

人皮肤黑色素瘤细胞由Oettgen F及其同事从一名29岁的患有广泛、快速进展性恶性黑色素瘤的白人男性患者的胸导管中分离建立的。该细胞可产生黑色素，电镜检测发现细胞中色素颗粒与自身合成和吞噬作用相关。在63%的恶性黑色素瘤患者和10%其他疾病患者体内发现了针对该细胞系的抗体。

人皮肤黑色素瘤细胞

人皮肤黑色素瘤细胞培养步骤：

一．人皮肤黑色素瘤细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备MEM-EBSS培养基(Minimum Essential Medium(MEM Eagles with Earle’sBalanced Salts)(MEM-EBSS))(MEM，GIBCO,41500034,添加EBSS)，90%；优质胎牛血清，10%。

2）人皮肤黑色素瘤细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为95%。

3）人皮肤黑色素瘤细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．人皮肤黑色素瘤细胞处理：

1）复苏人皮肤黑色素瘤细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人皮肤黑色素瘤细胞传代：

对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人皮肤黑色素瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。悬浮细胞冻存时，应将细胞收集，1000RPM条件下离心4分钟，少量保存上清液（防止细胞吸走），加入部分新鲜培养基，加入到冻存管中，在冻存管中加入10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

人皮肤黑色素瘤细胞可以用于VEPH1对皮肤黑色素瘤细胞周期、EMT和凋亡调控机制的研究

探讨VEPH1(Ventricular zone-expressed PH domain-containing protein homolog 1)影响皮肤黑色素瘤(Cutaneous melanoma,CM)细胞周期、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和凋亡等调控机制的研究。

方法:选取A375、B16-BL6、B16黑色素瘤细胞系以及人正常皮肤细胞(Ha Ca T)进行体外细胞培养,通过实时荧光定量聚合链式反应(qRT-PCR)检测VEPH1的m RNA表达水平,筛选最具有实验意义的黑色素瘤细胞系,进行转染、分组,共8组:空白组(未经处理)、阴性对照组(转染空白质粒)、VEPH1组(转染过表达VEPH1质粒)、SB-431542组(转染TGF-β受体抑制剂)、VEPH1+SB-431542组(共转染TGF-β信号通路抑制剂和过表达VEPH1质粒)、TGF-β组(转染过表达TGF-β质粒)、VEPH1+TGF-β组(共转染过表达TGF-β质粒和过表达VEPH1质粒)、si-VEPH1组(转染si-VEPH1质粒),采用q RT-PCR、Western Blot检测各组转染细胞系中VEPH1、Smad4、TGF-β、EMT相关蛋白的m RNA和蛋白的表达水平;采用流式细胞术检测各组转染细胞系的细胞周期、凋亡情况。

结果:A375黑色素瘤细胞系中VEPH1表达水平最低(P<0.05);在皮肤黑色素瘤细胞系中VEPH1和E-钙粘蛋白的mRNA和蛋白表达水平降低,而TGF-β、Smad4、波形蛋白和N-钙粘蛋白的表达水平升高(P<0.05);过表达VEPH1促进上皮标志物E-钙粘蛋白的表达,抑制TGF-β、Smad4和间质标志物N-钙粘蛋白、波形蛋白的表达;过表达VEPH1通过下调TGF-β信号通路可抑制皮肤黑色素瘤细胞的周期,促进皮肤黑色素瘤细胞的凋亡。

结论:VEPH1在皮肤黑色素瘤中呈低表达;过表达VEPH1通过TGF-β信号通路可抑制皮肤黑色素瘤细胞的周期、EMT,促进皮肤黑色素瘤细胞的凋亡。

参考文献

[1]Ventricular Zone Expressed PH Domain Containing 1(VEPH1):an adaptor protein capable of modulating multiple signaling transduction pathways during normal and pathological development.[J].Brown Theodore J;;Kollara Alexandra;;Shathasivam Premalatha;;Ringuette Maurice J.Cell communication and signaling:CCS,2019(1)

[2]Canonical signaling and nuclear activity of mTOR-a teamwork effort to regulate metabolism and cell growth.[J].Giguère Vincent.The FEBS journal,2018(9)

[3]Intracellular trafficking of transforming growth factorβreceptors.[J].Yakymovych Ihor;;Yakymovych Mariya;;Heldin Carl-Henrik.Acta biochimica et biophysica Sinica,2018(1)

[4]Exosomal signaling during hypoxia mediates microvascular endothelial cell migration and vasculogenesis.[J].Carlos Salomon;;Jennifer Ryan;;Luis Sobrevia;;Miharu Kobayashi;;Keith Ashman;;Murray Mitchell;;Gregory E Rice.PLoS ONE,2017(7)

[5]章君仪.VEPH1对皮肤黑色素瘤细胞周期、EMT和凋亡调控机制的研究[D].湖南师范大学,2021.