末端加A酶的应用

背景^[1]

高保真PCR酶利用自身的3’→5’外切酶活性（pfu DNA Polymerase，PrimeSTAR HS DNA Polymerase等）能保证PCR产物的保真度，但扩增的PCR产物为不带A尾的平末端DNA片段，不能直接TA克隆。因此，平末端DNA片段需要进行加A后方可TA克隆。平末端DNA加A的步骤一般是先纯化PCR产物，加入dATP Buffer利用Taq DNA polymerase在平末端片段后加上A尾后才能与T载体的T头互补连接TA克隆。步骤较为烦锁，要购买特定的dATP Buffer。经过优化后的A-Tailing Enzyme可以有效地将dAMP掺入平末端DNA片段的3′端。3′-dA DNA产物在随后的连接步骤中可防止相互形成多聚体。

应用^[2]

加A尾的DNA连接到具有互补dT突出端的连接子或克隆载体上。

用A-Tailing Enzyme模块加A尾的DNA可以连接到具有互补dT突出端的连接子或克隆载体上。

方法改进：平末端DNA片段加A方法根据实验者的技能程度推荐两种方法：

（1）保守法，先对平末端PCR产物纯化后，浓度要求至少20ng/ ul（大概就好，跑胶图像条带清晰，明亮），取14.5 ul PCR产物，加入2 ul Taq Buffer，3ul dNTP，0.5 ul Taq酶，在72度反应10~20min, 后直接回收纯化加A尾的DNA片段可用于TA克隆，此方法操作容易，成功率高；

（2）快速法，高保真酶PCR后的管子（体系为50ul）不用先纯化直接加入3ul dNTP 和0.5 ul Taq酶继续72度反应10~20min，此后直接回收或跑胶回收纯化加A尾的DNA片段可用于TA克隆，此方法操作步骤较少和方便，节省实验时间和实验经费。

结果：推荐的两种方法均能使平末端DNA片段加A尾，方便TA克隆。另外，使用dNTP 代替dATP，节省实验经费。

参考文献

[1] 末端加A酶产品介绍

[2]生物通