​磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原的制备方法

背景技术

目前，农兽药残留已给我国食品的安全供应带来严重的危害，药物残留涉及的药物种类越来越多，磺胺间二甲氧嘧啶(SDM)也是其中之一。磺胺间二甲氧嘧啶是一种人造抗生素，作为饲料添加剂广泛添加到动物饲料中。目前农兽药残留物的检测多通过酶联免疫分析的方法，通过特异的抗体抗原反应，来检测外来抗原的存在。磺胺间二甲氧嘧啶是小分子化合物，必须同载体蛋白结合形成全抗原，从而诱导抗体的产生。目前，在ELISA中，比较常用的载体是动物源的载体，但是存在一定的免疫缺陷。制备出的抗体的亲和力较差，可迅速被肾脏系统消除；与免疫动物的亲缘关系较近，会一定程度上增加阳性克隆筛选的难度和工作量；此载体蛋白质存在着很大的安全隐患，可能携带病毒。因而，探索并使用新型的非动物源性的免疫载体将逐渐成为未来的发展趋势。这种载体应该同免疫动物的亲缘关系较远，且具有比较稳定的结构和较强的水溶性，在有机溶剂存在的状态下能和半抗原进行交联，制备抗体的亲和力良好，检测灵敏度较高。

11S球蛋白分子量为302000-375000,它是由6个酸性亚基(A1、A2、A3、A4、A5、A6)和6个碱性亚基(B1 B2 B3 B4 B5 B6)构成的两个环状六角形结构,酸性和碱性亚基交互对应，通过二硫键连接，形成比较稳定的结构形式。酸性亚基A1、A2、A3的等电点为pH5.15、pH5.40、pH4.75，碱性亚基B1、B2、B3的等电点为pH8.0、pH8.25、pH8.5。酸性亚基是大豆蛋白中主要起抗原作用的亚基，因此可以尝试在免疫反应中用作载体。大豆11S球蛋白酸性亚基溶解度较高，同免疫动物的亲缘关系较远，制备抗体的亲和力良好，检测灵敏度较高。

磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原的制备方法

包括以下步骤：

(1)将0.05mmol的磺胺间二甲氧嘧啶小分子与26.26mg的EDC-HCl混合，加入无水N,N-二甲基甲酰胺DMF使其全部溶解，为A液，取5mg的载体蛋白溶于0.02M，pH＝7.4的PBS中，为B液；

(2)将A液缓慢滴加到B液中，在室温下搅拌反应4～6h，然后4℃冰箱过夜；

(3)反应产物在pH＝7.4的PBS缓冲溶液中透析3天，得到纯化的磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原，测定其浓度，分装，-20℃保存。

所述载体蛋白大豆11S球蛋白酸性亚基的制备方法如下：

(1)以1:10的比例将大豆11S球蛋白溶于Tris-HCl缓冲液，加β巯基乙醇之后调节混合溶液的整体浓度至0.015mol.L-1，调pH为8.0，在90℃条件下水浴30min；

(2)收集除去碱性亚基的上清液，调pH至5.0，4℃、6500r·min-1条件下离心20min分离沉淀，调pH至中性，冷冻干燥后即得大豆11S球蛋白酸性亚基。

一种磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原用于制备磺胺间二甲氧嘧啶抗体。

一种磺胺间二甲氧嘧啶抗体，使用所述磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原作为免疫抗原免疫巴比氏小鼠得到单克隆细胞株，分离纯化后得到磺胺间二甲氧嘧啶单克隆抗体。

单克隆抗体在检测磺胺类化合物中的应用。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明利用碳二亚胺法将磺胺间二甲氧嘧啶与非动物源的载体大豆11S球蛋白酸性亚基成功连接形成新型抗原，并顺利生产出单克隆抗体。大豆11S球蛋白酸性亚基有稳定的结构，可在有机溶剂条件下同磺胺间二甲氧嘧啶等小分子半抗原连接，并与免疫动物保持较远的亲缘关系，因此可作为新型的免疫载体，以尝试取代牛血清白蛋白。