PLC/PRF/5（人肝癌亚力山大细胞）的应用

背景^[1-3]

PLC/PRF/5（人肝癌亚力山大细胞）于1976年建系，细胞来自一位患有原发性HCC的莫桑比克男性患者的标本；为上皮样贴壁生长;AFP阳性，不产生白蛋白；分泌ad亚型的HBsAg而不产生HBcAg或HBeAg和Dane颗粒，却可维持HAV的繁殖；该细胞可能含有全部HBV基因组，同工酶谱及核型与人类同源；裸鼠异种移植可致此细胞系因其产生HBsAg的物理化学和免疫化学特性跟HBV携带者血清中HBsAg相似。因此，可被用来研究HBV体外病毒及其与原发性肝癌的关联，抗HBV疫苗所需的HBsAg颗粒的制备及抗病毒药物的制备等方面。

PLC/PRF/5（人肝癌亚力山大细胞）

PLC/PRF/5（人肝癌亚力山大细胞）培养操作规程:

培养基及培养冻存条件准备

1）准备MEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

细胞处理

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

3.轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1，细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2，4min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x10E6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

PLC/PRF/5（人肝癌亚力山大细胞）可以用于二甲双胍及AICAR激活AMPK诱导肝癌细胞株PLC/PRF/5增殖抑制

通过二甲双胍对肝癌细胞PLC/PRF/5增殖抑制、细胞周期的影响及其作用分子机制的研究，为AMPK成为抗肿瘤治疗的新靶点以及二甲双胍成为抗肿瘤药物的应用提供理论依据。

材料和方法1.用含10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基培养人肝癌细胞株PLC/PRF/5细胞及人宫颈癌细胞株HeLa细胞；HeLa细胞缺乏LKB1基因,而LKB1基因是AMPK上游激酶，因此，实验中采用HeLa细胞做为阴性对照。

2. 用含10mM的二甲双胍培养基和1000μM的AICAR的培养基作用PLC/PRF/5细胞15min，以未予药物处理细胞为对照，Western Blot检测AMPK磷酸化程度。

3. 用含不同浓度二甲双胍(2.5、5.0、10、20mM)，AICAR(200、500、1000、2000μM)的培养基分别处理PLC/PRF/5细胞24、48、72h；用含10mM的二甲双胍培养基和1000μM的AICAR的培养基分别处理HeLa细胞24、48、72h,以未予药物处理细胞作对照;噻唑蓝比色法(MTT法)检测二甲双胍及AICAR对PLC/PRF/5细胞及HeLa细胞增殖的影响。

4. PLC/PRF/5细胞用含10mM的二甲双胍的培养基和1000μM的AICAR的培养基作用72h，经碘化丙啶(PI)单染法，用流式细胞分析仪(FCM)检测PLC/PRF/5细胞周期情况。

5. PLC/PRF/5细胞用含10mM的二甲双胍的培养基和1000μM的AICAR的培养基作用72h，DAPI染色观察PLC/PRF/5细胞凋亡情况。

结果1.Western Blot结果显示，经二甲双胍及AICAR处理后，PLC/PRF/5细胞AMPK磷酸化程度较对照组明显增强。

2. MTT法检测结果显示，与对照组比较，二甲双胍及AICAR能明显抑制PLC/PRF/5细胞的生长，并且呈浓度依赖性;而二甲双胍及AICAR对HeLa细胞的生长无抑制作用。

3. 流式细胞术检测结果显示，PLC/PRF/5细胞经二甲双胍及AICAR处理24h后，细胞周期发生停滞，G0-G1期，S期，G2-M期和对照组相比较,差别均具有统计学意义。

4. DAPI染色观察可见，PLC/PRF/5细胞经二甲双胍及AICAR处理24h后，镜下可见部分PLC/PRF/5细胞核碎裂,细胞发生凋亡。

结论1.二甲双胍及AICAR能够使肝癌细胞PLC/PRF/5 AMPK激活。2.二甲双胍及AICAR通过激活AMPK，诱导肝癌细胞PLC/PRF/5增殖抑制,细胞周期停滞。3.二甲双胍及AICAR可诱导PLC/PRF/5细胞凋亡。

参考文献

[1]Therapeutic metformin/AMPK activation promotes the angiogenic phenotype in the ERαnegative MDA-MB-435 breast cancer model[J].Kathryn N.Phoenix;;Frank Vumbaca;;Kevin P.Claffey.Breast Cancer Research and Treatment,2009(1)

[2]AMP-Activated Protein Kinase and Autophagy[J].Alfred J.Meijer;;Patrice Codogno.Autophagy,2007(3)

[3]Dual antiglioma action of metformin:cell cycle arrest and mitochondria-dependent apoptosis[J].A.Isakovic;;L.Harhaji;;D.Stevanovic;;Z.Markovic;;M.Sumarac-Dumanovic;;V.Starcevic;;D.Micic;;V.Trajkovic.Cellular and Molecular Life Sciences,2007(10)

[4]DRAM,a p53-Induced Modulator of Autophagy,Is Critical for Apoptosis[J].Diane Crighton;;Simon Wilkinson;;Jim O'Prey;;Nelofer Syed;;Paul Smith;;Paul R.Harrison;;Milena Gasco;;Ornella Garrone;;Tim Crook;;Kevin M.Ryan.Cell,2006(1)

[5]王钦加.二甲双胍及AICAR激活AMPK诱导肝癌细胞株PLC/PRF/5增殖抑制[D].汕头大学,2010.