Beta-TC-6（小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞）的应用

背景^[1-3]

Beta-TC-6（小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞）来源于转基因小鼠中生长的一个胰肿瘤(胰岛素瘤)，这种小鼠携带了大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子调控的SV40早期基因的假基因结构。Beta-TC-6细胞包含大量的胰岛素和小量的胰高血糖素及生长抑素；Beta-TC-6细胞能响应葡萄糖而分泌胰岛素。

Beta-TC-6（小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞）

细胞特性

1）来源：胰岛素瘤

2）形态：上皮细胞样，贴壁生长，少量悬浮。

3）含量：>1x106细胞数

4）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

Beta-TC-6（小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞）培养步骤：

1）准备DMEM(含1.5g/LNaHCO3）培养基；优质胎牛血清，15%；双抗1%。

注意事项：

1.Beta-TC-6细胞生长缓慢，这些细胞从冷冻保存中恢复需要几天的时间。开始时通常具有少量可存活的漂浮细胞，其最终会形成簇并粘附在培养瓶底部，它们成簇地连接并形成堆积细胞的岛屿。细胞不会完全百分之百融合，培养物上会粘附可存活的漂浮细胞，可通过温和离心保留。在添加细胞前，培养基至少要提前15-30分钟平衡温度和PH。

2.该细胞在DMEM(含1.5g/LNaHCO3)培养基中生长良好，大部分品牌的DMEM含有较高浓度的NaHCO3（3.7g/L），若使用DMEM（3.7g/LNaHCO3）培养基培养细胞时需要提高CO2浓度（7%-10%）。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

Beta-TC-6（小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞）细胞处理：

冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。

1.收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.将收集到的悬浮细胞、pbs清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

应用^[4][5]

Beta-TC-6（小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞）可以用于骨钙素对脂毒性Beta-TC-6细胞胰岛素分泌障碍的影响及其机制研究

研究过表达成骨细胞胰岛素受体对成骨细胞分化及骨钙素表达的影响,进一步探讨成骨细胞分泌的骨钙素能否改善脂毒性引起的Beta-TC-6细胞胰岛素分泌障碍及其可能的机制。

方法:1.实验设计:本研究的重点是“骨钙素—胰岛素环路”,选用的细胞为小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1和小鼠胰岛素瘤细胞Beta-TC-6。实验分为两部分,部分研究过表达MC3T3-E1细胞Ins R基因,探讨其对糖脂毒性成骨分化障碍的影响。第二部分研究成骨细胞分泌的骨钙素以及外源性骨钙素能否促进Beta-TC-6细胞胰岛素的合成与释放,改善β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)功能,并进行机制探讨。

2. 应用慢病毒质粒转染方法过表达MC3T3-E1细胞胰岛素受体(Ins R)基因,探讨其对糖脂毒性成骨细胞分化障碍及骨钙素表达的影响;进一步收集分化后的条件培养基干预Beta-TC-6细胞,Western blot、q PCR检测Beta-TC-6细胞骨钙素受体(Gprc6a)、GSIS相关葡萄糖转运体(Glut2)、胰岛素的变化趋势,探讨其能否改善胰岛素分泌功能。

3. 用外源骨钙素和高脂干预胰岛Beta-TC-6细胞,Western blot检测Gprc6a、Glut2以及PI3K/AKT/Fox O1/Pdx1信号通路的变化趋势,GSIS试验检测β细胞胰岛素的分泌量,q PCR检测Gprc6a、Glut2、胰岛素m RNA的改变,流式细胞术检测β细胞的凋亡情况;进一步使用PI3K抑制剂,观察是否可阻断骨钙素的上述效应。

4. 应用慢病毒质粒转染方法敲低胰岛Beta-TC-6细胞Gprc6a基因,并使用Fox O1抑制剂、Pdx1激活剂分别干预PI3K/AKT/Fox O1/Pdx1通路的关键分子,探讨骨钙素促进胰岛素分泌的相关机制。

结果:1.诱导分化14天成骨细胞骨钙素与Runx2蛋白合成分泌量达高峰(P<0.05),矿化结节较多,证明本实验最适诱导时间为14天。

2. 与对照组相比,高糖高脂干预可明显降低Runx2和骨钙素水平(P<0.05),矿化结节减少,证明糖脂毒性可抑制成骨分化。

3. 过表达成骨细胞的Ins R基因可增加Runx2、骨钙素的表达(P<0.05),促进成骨细胞分化,改善高糖高脂导致的成骨细胞分化障碍(P<0.05)。

4.使用过表达Ins R的成骨细胞条件培养基干预,可上调β细胞膜Glut2、Gprc6a的表达,增加Beta-TC-6细胞胰岛素m RNA水平,并改善脂毒性引起的Beta-TC-6细胞Glut2、胰岛素的下调,且上述作用可被骨钙素中和抗体抑制(P<0.05)。

参考文献

[1]The carboxylation status of osteocalcin has important consequences for its structure and dynamics[J].Kapoor Karan;Pi Min;Nishimoto Satoru Kenneth;Quarles Leigh Darryl;Baudry Jerome;Smith Jeremy C..Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects,2020(prep)

[2]Highly Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Pancreatic Progenitors Co-expressing PDX1 and NKX6.1.[J].Memon Bushra;Abdelalim Essam M.Methods in molecular biology(Clifton,N.J.),2020

[3]Targeting Pyruvate Kinase PEPs Up Insulin Secretion and Improves Glucose Homeostasis[J].Corkey Barbara E..Cell Metabolism,2020(5)

[4]Pharmacology and physiological function of the orphan GPRC6A receptor.[J].J?rgensen Christinna V;;Br?uner-Osborne Hans.Basic&clinical pharmacology&toxicology,2020(s6)

[5]张亚芳.骨钙素对脂毒性Beta-TC-6细胞胰岛素分泌障碍的影响及其机制研究[D].福建医科大学,2021