3, 4-二羟基苯甲酸乙酯的研究进展与制备

3, 4-二羟基苯甲酸乙酯又名原儿茶酸乙酯，(ethyl protocatechuate, 又称ethyl 3, 4-dihydroxybenzoate, 3, 4-dihydroxybenzoic acid ethyl ester, ethyl-3,4-dihy-droxybenzoate, protocatechuic acid ethyl ester, EDHB)。EDHB的分子式为C₉H₁₀O₄，分子中含有2个酚羟基、1个乙酯基，可由原儿茶酸和乙醇酯化形成，其相对分子质量为182.1733，结构式如下图。

EDHB为白色或浅棕黄色结晶性粉末。无臭或微有酚臭，味微苦，熔点132~135℃，不溶于水，溶于乙醇。由3,4-二羟基苯甲酸与乙醇酯化而得。EDHB中含有酚羟基，具有还原性，可被氧化，因此可用于油脂、奶油的防氧化，用于食品添加剂、医药中间体等。EDHB广泛存在于多种植物中，如玄参科婆婆纳属植物水蔓菁、毛莨科植物黄连、文冠果属植物文冠果、菊科植物鬼针草、伞形科柴胡属植物抱茎柴胡等几十种植物。这些植物大多是中药材，有抗肿瘤、抗菌消炎、镇痛等功效。EDHB主要来源于植物的叶、根等部位，由有机溶剂提取获得，同时在花生种皮、葡萄酒及茶叶中也发现EDHB。^[1]

研究进展[1]

（1）EDHB的抗氧化作用

在对花生种皮成分研究中发现，EDHB为其乙醇提取物中的一种组成成分，起到抗氧化作用。研究显示在德国雷司令葡萄酒成分中，通过HPLC鉴定出EDHB，提示其主要发挥抗氧化作用。Sawai等对茶叶中的抗氧化成分分析显示其含EDHB，但其抗氧化活性比较低 。同时，研究表明EDHB对临床分离株的金黄色葡萄球菌具有抗菌活性，并对克林霉素、红霉素和万古霉素具有协同效应。

（2）EDHB在胶原合成的抑制作用

胶原也称胶原蛋白，一种纤维蛋白，原胶原分子是其基本组成单位。胶原蛋白显示出特殊的三股螺旋缠绕的结构，三条相互独立的胶原蛋白肽链依靠甘氨酸之间形成的氢键维系三股螺旋相 缠绕的结构，具有支撑器官、保护机体的作用，也是组成细胞间质和基底膜的重要功能蛋白质。胶原脯氨酸羟化酶是双加氧酶超家族的一员，其需要O和α-酮戊二酸作为底物，可以被α-酮戊二酸底物类似物竞争性抑制。EDHB作为作α-酮戊二酸底物类似物，能够作为胶原脯氨酰羟化酶的抑制剂。在胶原合成过程中，胶原的基本结构单位是原胶原，其肽链的一级结具有(Gly-X-Y)n重复单位，其中X和Y可以是任何一种氨基酸，但常为脯氨酸和羟脯氨酸，少数为赖氨酸和羟赖氨酸。在原胶原合成的过程中，在内质网中未折叠 的胶原蛋白链进行不同的翻译后修饰，脯氨酸4-羟化酶羟基Y位置的脯氨酸，用于稳定三螺 旋结构。因此，EDHB作为作仅酮戊二酸底物类似物，有效抑制胶原脯氨酰羟化酶的活性，使得胶原无法形成稳定的三维结构，抑制胶原的合成。

（3）EDHB调节乏氧诱导因子作用

乏氧诱导因子(hypoxiainduciblefactor，HIF)是乏氧反应的关键调节因子，HIF-1是由HIF-1α及HIF-1β两个亚基组成的异源二聚体。HIF-1α与HIF-1β形成异二聚体才能成为有活性的HIF-1。亚基为HIF-1，它既是HIF-1的调节亚基又是活性亚基，其蛋白稳定性和转录活性均受细胞内氧浓度的调节。因此，HIF-1的生理活性主要取决于HIF-1α亚基的活性和表达。在正常生理条件下，HIF-1α氨基酸残基Pro420和Pro0564被脯氨酸羟化酶(pro-1ine hydroxylase，PHD)羟基化后，经Hippel-Lindau蛋白结合，HIF-1α蛋白泛素化，通过蛋白酶体降解(vonHippel-Lindauprotein，pVHL，E3泛素连接酶复合物的组成 部分)介导通过泛素途径降解。EDHB通过抑制脯氨酸羟化酶而抑制泛素降解途径，使HIF-1α免受降解，稳定HIF-1α蛋白。因此，EDHB可以参与调控HIF-1介导的下游基因表达，如促红细胞生成素及血管内皮生长因子表达，从而发挥重要的生物学效应。EDHB可以保护L6肌细胞不受氧损伤,并且在乳腺癌中可以抑制胶原的分泌，从而抑制肿瘤的转移，因此对乳腺癌的治疗具有一定的指导作用。

（4）EDHB对离子的螯合作用

EDHB能够螯合酶结合的离子，例如铁离子等。Wang等研究表明，EDHB对铁胺的螯合能力低于强铁螯合剂，但其能够造成细胞的铁缺乏，促进铁调节蛋白调控网络的激活，增加的铁调节蛋白表达，同时增加在转铁蛋白受体的水平。

制备方法

以4-甲基邻苯二酚为原料，通过氧化、酯化两步来合成3, 4-二羟基苯甲酸乙酯。4-甲基邻苯二酚先与高锰酸钾在催化剂TBAB(四叔丁基溴化铵)作用下发生反应，生成3, 4-二羟基苯甲酸；再在催化剂TsOH(对甲基苯磺酸)作用下与乙醇反应，最后合成目标3, 4-二羟基苯甲酸乙酯。产率可达90.5%。^[2]

光谱学信息

通过KBr压片法，目标产物在3380cm^-1处吸收峰是苯环中的氢=C-H，在2954cm^-1处吸收峰是甲基-CH3的面外弯曲振动；2875cm^-1处吸收峰是亚甲基-CH2-的收缩振动特征吸收峰；1687cm^-1处吸收峰是羰基-C=O的伸缩振动的特性吸收峰；1604 cm^-1处吸收峰是苯环C=C的伸缩振动的特性吸收峰；1295cm^-1处苯环对位羟基-OH伸缩振动的特征吸收峰；1221cm^-1处苯环邻位羟基-OH伸缩振动的特征吸收峰，表明目标产物中有羧酸的存在。 ^[2]

核磁共振（NMR）：^[3]

¹H NMR (400 MHz, CD₃SOCD₃): δ 9.74 (brs, 1 H), 9.33 (brs, 1 H), 7.36 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 7.31 (dd, J = 2.0, 8.4 Hz, 1 H), 6.80 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.21 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.27 (d, J = 7.2 Hz, 3 H).

¹³C NMR (100 MHz, CD₃SOCD₃): δ 165.6, 150.3, 145.0, 121.7, 120.8, 116.2, 115.2, 59.9, 14.2 ppm

参考文献

[1] 周石洋, 陈玲, 黄坤林. 3, 4-二羟基苯甲酸乙酯合成工艺研究[J]. 黑龙江大学工程学报, 2013(5), 4(2): 27-32.

[2] 韩波, 胡丽丽, 米丽华, 等. 原儿茶酸乙酯研究进展[J]. 生命的化学, 2016, 36(6): 885-890.

[3] Liang, Y.-F.; Li, X.; Wang, X.; Zou, M.; Tang, C.; Liang, Y.; Song, S.; Jiao, N. Conversion of simple cyclohexanones into catechols. J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 12271– 12277.