大鼠细胞色素P450(CYP450)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

大鼠细胞色素P450(CYP450)ELISA KIT用于检测血液、血清、胸腹水等其他体液中细胞色素P450(CYP450)的含量。

实验原理：大鼠细胞色素P450(CYP450)ELISA KIT是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被细胞色素P450(CYP450))捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的细胞色素P450(CYP450)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

大鼠细胞色素P450(CYP450)ELISA KIT

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

大鼠细胞色素P450(CYP450)ELISA KIT用于大鼠肝脏细胞色素P450酶水平对何首乌肝毒性的影响

考察大鼠肝脏细胞色素P450酶水平对何首乌肝毒性的影响。

方法:采用雄性的SD大鼠,200±10g,随机将大鼠分为六组,分别是:空白对照组(a)、何首乌对照组(b)、CYP1A2抑制对照组(c)、CYP2E1抑制对照组(d)、何首乌+CYP1A2抑制组(e)、何首乌+CYP2E1抑制组(f);单次灌胃何首乌水提物实验:CYP1A2抑制对照组(c)、何首乌+CYP1A2抑制组(e)组于灌胃何首乌前5d开始腹腔注射CYP1A2抑制剂西咪替丁50mg/kg BW,CYP2E1抑制对照组(d)、何首乌+CYP2E1抑制组(f)组于灌胃何首乌前2.5h腹腔注射CYP2E1抑制剂反式1,2-二氯乙烯100mg/kg BW,何首乌对照组(b)、何首乌+CYP1A2抑制组(e)、何首乌+CYP2E1抑制组(f)组单次灌胃何首乌水提物40g/kg BW,并于给药后2h、4h、24h、48h和72h眼眶取血;长期反复间隔灌胃何首乌水提物:CYP1A2抑制对照组(c)、何首乌+CYP1A2抑制组(e)组于灌胃何首乌前5d开始腹腔注射CYP1A2抑制剂西咪替丁50mg/kg BW(连续抑制,间隔,再次抑制,再次间隔,再次抑制),CYP2E1抑制对照组(d)、何首乌+CYP2E1抑制组(f)组于灌胃何首乌前2.5h腹腔注射CYP2E1抑制剂反式1,2-二氯乙烯100mg/kg BW(连续抑制,间隔,再次抑制,再次间隔,再次抑制),何首乌对照组(b)、何首乌+CYP1A2抑制组(e)、何首乌+CYP2E1抑制组(f)组灌胃何首乌水提物40g/kg BW,连续1w,间隔2w,再次给药1d,再间隔3w,再次给药3d,每次灌胃何首乌后2h取血测大鼠肝脏转氨酶AST(天门冬氨酸氨基转移酶,谷草转氨酶)和ALT(丙氨酸氨基转移酶,谷丙转氨酶)活性,“cocktail”探针药物法测肝微粒体5种细胞色素P450酶活性,肝脏组织切片并HE染色,分析肝脏病理学切片。

结果:单次灌胃何首乌水提物:每日观察、测体重,大鼠会出现怠动、毛色不华等状况,体重在24h之内下降;2h、4h、24h、48h、72h连续取血测定,大鼠肝脏转氨酶ALT和AST在24h之内受到影响,在2h时ALT和AST显著升高,4h、24h分别是AST、ALT显著升高。长期反复间隔灌胃何首乌水提物:连续灌胃1w,ALT和AST显著升高,间隔2w再次给药1d,ALT和AST再次显著升高,再次间隔3w,再次给药3d,ALT和AST再次显著升高;实验结束后检测各组肝微粒体酶活性,结果何首乌对照组的CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9、CYP2D6活性均明显下调,CYP1A2抑制剂对照组的CYP1A2活性明显下调,CYP2E1抑制剂对照组的CYP2E1和CYP2C9活性明显下调,何首乌+CYP1A2组主要表现CYP1A2和CYP2D6活性下调,何首乌+CYP2E1组主要表现CYP2E1和CYP2D6活性下调、及CYP3A4酶活性的上调;各组大鼠的肝脏病理学分析发现,与各对照组相比,CYP1A2或CYP2E1抑制剂预处理加何首乌灌胃处理组有明显肝脏损伤。

结论:大鼠肝脏细胞色素P450酶活性水平与何首乌所致肝损伤有关,抑制肝细胞中CYP1A2和CYP2E1的表达可致何首乌相关大鼠急性肝毒性。

参考文献

[1]Drug-Induced Idiosyncratic Hepatotoxicity:Prevention Strategy Developed after the Troglitazone Case[J].Toshihiko Ikeda.Drug Metabolism and Pharmacokinetics,2011(1)

[2]Genetic polymorphism of CYP1A2 and the toxicity of leflunomide treatment in rheumatoid arthritis patients[J].Petra Bohanec Grabar;;Bla?Rozman;;Matija Tom?i?;;Da?a?uput;;Du?an Logar;;Vita Dol?an.European Journal of Clinical Pharmacology,2008(9)

[3]Troglitazone-induced liver failure:a case study[J].David J Graham;;Lanh Green;;John R Senior;;Parivash Nourjah.The American Journal of Medicine,2003(4)

[4]Cytochrome P450 enzyme polymorphisms and adverse drug reactions[J].Munir Pirmohamed;;B.Kevin Park.Toxicology,2003(1)

[5]葛珍珍.大鼠肝脏细胞色素P450酶水平对何首乌肝毒性的影响[D].北京中医药大学,2014.