碱性磷酸酶显色试剂盒的应用

背景^[1-3]

碱性磷酸酶显色试剂盒是一种用于免疫组化显色、Western等膜显色和诱导多功能干细胞iPS鉴定等的试剂盒。BCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物，在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。

碱性磷酸酶显色试剂盒

碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AP/ALP/AKP/ALKP/ALPase/Alk Phos)也称碱性磷酸酯酶(EC 3.1.3.1)，可以在碱性条件下催化磷酸酯键的水解。哺乳动物中，肝脏、胆管、肾脏、骨头和胎盘中的碱性磷酸酶活性比较高。常见的碱性磷酸酶包括肠道碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,intestinal,ALPI)、非组织特异性碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,tissue-nonspecific isozyme,ALPL)和胎盘碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,placental type,也称placental alkaline phosphatase,PLAP)。常见的小牛肠碱性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase,CIAP/CIP)被广泛用于二抗等的标记最终用于蛋白和核酸等的检测，也常用于DNA或RNA 5'和3'末端的去磷酸化(去单磷酸化)，特别是质粒的5'末端去磷酸化以避免质粒自连等。

碱性磷酸酶显色试剂盒可以检测细胞或组织样品的裂解或匀浆产物的上清液、血浆、血清、尿液或纯化的酶样品等中的碱性磷酸酶活性。

Para-nitrophenyl phosphate(pNPP)是一种常用的磷酸酶显色底物，在碱性条件下，可在碱性磷酸酶作用下生成para-nitrophenol。para-nitrophenol(p-nitrophenol)在碱性条件下，呈黄色产物，可以在400-415nm检测吸光度。产物黄色越深，说明碱性磷酸酶检活性越高，反之则酶活性越低。据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。

应用^[4][5]

用于人肠碱性磷酸酶重组表达及调节人白细胞释放TNF-α和IL-6的活性研究

炎症几乎参与人类所有疾病的病理过程。人体主要的炎症细胞是血液中的白细胞,白细胞迁移到疾病部位并分泌促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6）的能力对炎症的发展尤为重要,因此控制白细胞炎症因子TNF-α和IL-6的分泌是非常重要的。

内毒素脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的有毒成分,大量进入血液循环可以与TLR4受体结合,诱导炎症细胞和血管内皮细胞释放关键炎症因子TNF-α等,并激活炎症级联反应。人肠碱性磷酸酶（IAP）通过灭活LPS,仅被用于治疗LPS引起的炎症性疾病。目前尚不清楚IAP是否有治疗非LPS依赖（即不通过TLR4受体）炎症性疾病的作用。

为了研究IAP对人白细胞炎症因子TNF-α和IL-6释放的作用和IAP的非LPS依赖信号传导通路,本研究首先利用CHO表达系统制备高纯度重组人肠道碱性磷酸酶（rec IAP）。其次,利用人新鲜提取的白细胞建立炎症细胞模型,研究rec IAP在LPS存在和不存在的条件下对人白细胞TNF-α和IL-6的作用。最后,研究在中性p H下rec IAP生理底物的去磷酸化产物,包括ATP、ADP、AMP和腺苷等对白细胞分泌TNF-α的影响。本实验中使用人新鲜提取的白细胞研究rec IAP的相关功能,接近rec IAP在人体中实际的药学应用,具有重要意义。

主要研究结果如下:（1）rec IAP在CHO的表达为获取高纯度rec IAP,使用CHO细胞进行表达,成功筛选出5株表达rec IAP的CHO稳定株。基于基础表达量和流加培养的结果,筛选出一株表达量最高的CHO细胞株作为种子细胞系,扩大培养并收取细胞培养液后浓缩纯化,获得rec IAP的分子量在70 k Da左右,纯度为92.45%,酶活为140.125 U/m L。

（2）rec IAP对人白细胞TNF-α和IL-6的活性研究利用鲎试剂检测rec IAP对LPS活性的影响,验证了rec IAP灭活LPS是剂量依赖和p H依赖的。LPS诱导新鲜提取的人白细胞以剂量依赖性方式分泌TNF-α。

结果显示,无论是LPS与rec IAP预处理后刺激白细胞,还是LPS和rec IAP同时刺激白细胞,都以相似的程度明显抑制白细胞TNF-α的分泌（p<0.05）,表明rec IAP抑制白细胞分泌TNF-α的作用与LPS关系不密切。而且在LPS存在或不存在的条件下,rec IAP都显著抑制白细胞分泌TNF-α和IL-6（p<0.05）,证明rec IAP抑制人白细胞分泌TNF-α和IL-6是非LPS依赖的。

并且在生理p H下,rec IAP能使ATP脱磷并逐步生成ADP、AMP和腺苷。并且rec IAP可在LPS不存在的条件下通过使特定分子（例如ATP,ADP和AMP）脱磷酸产生游离腺苷抑制白细胞TNF-α的释放。以上结果证明了rec IAP非LPS依赖抑制人白细胞TNF-α和IL-6的作用,表明rec IAP不仅可以治疗与LPS相关的疾病,还有望成为与白细胞TNF-α和IL-6分泌有关疾病的治疗候选药物,扩大了rec IAP的临床应用范围。

参考文献

[1]Focusing on Adenosine Receptors as a Potential Targeted Therapy in Human Diseases[J].Wiwin Is Effendi,Tatsuya Nagano,Kazuyuki Kobayashi,Yoshihiro Nishimura.Cells.2020(3)

[2]Bone alkaline phosphatase:An important biomarker in chronic kidney disease–mineral and bone disorder[J].Adrien Nizet,Etienne Cavalier,Peter Stenvinkel,Mathias Haarhaus,Per Magnusson.Clinica Chimica Acta.2020(C)

[3]Recent advances in intestinal alkaline phosphatase,inflammation,and nutrition.[J].Lallès Jean-Paul.Nutrition reviews.2019(10)

[4]More friend than foe:the emerging role of neutrophils in tissue repair[J].Moritz Peiseler,Paul Kubes.Journal of Clinical Investigation.2019(7)

[5]秦璐楠.人肠碱性磷酸酶重组表达及调节人白细胞释放TNF-α和IL-6的活性研究[D].东北农业大学,2020.