千金藤素在制备抗sars病毒药物中的应用

背景技术

自正式确定非典型肺炎的病原体为SARS冠状病毒以来，对于非典型肺炎及其病原体的防治和研究取得了极大进展，抗SARS冠状病毒药物和疫苗研制工作也在全力进行。SARS病毒是一种新型的冠状病毒，具有较强的传染性和变异性。目前SARS还缺乏特效的治疗，目前的治疗包括抗病毒治疗如利巴韦林，血清疗法等，用激素降低免疫系统对肺的损伤，用抗生素治疗潜在的细菌感染，辨证的中西医结合治疗；呼吸机的应用以及应激和ARDS的对症支持治疗等。抗SARS药物研制目前尚处于初期阶段。

国内外多家实验室用各种方式在不同水平正进行着抗SARS病毒药物的筛选工作。国内军事医学科学院研制的ω干扰素作为一种辅助性治疗SARS药物已通过鉴定，中国科学院上海药物研究所以非典病毒E蛋白、N蛋白和(3CL)蛋白水解酶作药靶，初步筛选到可能有抗SARS病毒活性的药物19种，但是尚未见到有明确抗SARS病毒药物的体外细胞实验结果报道。千金藤素为米黄色粉末，经图谱(红外、紫外、核磁、质谱)分析结果证明符合分子式C37H38N2O6，分子量为606.686，用非水滴定法测定纯度达95％以上。本品易溶于氯仿、甲醇、乙醇，不溶于水。临床上主要用于防治肿瘤患者因放、化疗及其它原因所致的白细胞减少症，是从防己科千金藤属(Stephanialour)植物中提取分离出来的生物碱。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供千金藤素在制备抗SARS病毒药物中的应用。

本发明是以千金藤素为有效成分制备抗SARS病毒药物，可采用常规的制备工艺，制备成不同的药物剂型供患者使用，如制成口服液、胶囊、粉剂、针剂等。

药物注射液的用法与用量：通常成人，一次50mg，一日一次，(与250ml 5％葡萄糖液混匀后，也可不加葡萄糖。)缓缓静脉滴注。

(1)以千金藤素为有效成分制备的抗SARS病毒药物作用如下：1、药物对细胞的保护作用以不同浓度药物加到长满单层用于体外培养SARS病毒的Vero-E6细胞株Vero-E6细胞的96孔板中，培养2h后弃药液，接种100TCID50的SARS-CoV病毒液，37℃吸附5％CO2培养48h，观察药物处理后的细胞对SARS-CoV感染的影响。同时做单用病毒感染时的病毒对照、正常细胞对照。结果显示：在Vero-E6细胞上的无毒浓度为10μg/mL。

(2)药物对SARS-CoV的直接杀伤作用含不同浓度药物的维持液与等量病毒液后，置37℃作用2h后，将孵育液加入长满单层Vero-E6细胞的96孔板中，0.1ml/孔，37℃吸附1h，换上含相应浓度药物的维持液，继续培养48h，观察药物对SARS-CoV的直接杀伤作用。结果显示：不同浓度药物与病毒等量混合2h后，在10μg/ml时对细胞感染SARS-CoV皆有全抑制作用。

(3)药物对SARS-CoV感染细胞的综合作用药物和病毒等量混合后直接加到长满单层Vero-E6细胞的96孔板上37℃吸附2h，弃混合液加维持液，继续培养4gh，观察药物对SARS-CoV感染细胞的综合作用。结果显示：千金藤素对SARS-CoV感染细胞的综合作用效果为：8ug/ml有抑制作用，浓度为10ug/ml时，对SARS-CoV病毒有100％的抑制效果。

(4)药物对病毒感染细胞的预防作用不同浓度药物预先与细胞作用2h后，接种病毒，千金藤素在10μg/mL时可以66％抑制SARS病毒感染的Vero-E6细胞病变。

(5)药物对病毒感染细胞的治疗作用千金藤素在10μg/ml时对细胞感染SARS-CoV有全部抑制作用。

本发明与现有技术相比具有如下优点：1、在安全剂量范围内，对SARS病毒的抑制率高。

2、有较强的预防SARS病毒感染的作用。

3、愈后快，可以减轻感染病人的综合症状。

4、药物毒性小，稳定性好，耐药性强。

具体实施方式

实验材料：受试药物是千金藤素，实验时用生理盐水配成混悬液，供实验用。

2、实验动物  昆明种小鼠，体重(20±2)g；Wistar大鼠，体重(270±20)g；C57BL/6小鼠，体重(20±2)g。

3、经口灌胃给药的急、慢性毒性试验 

①对小鼠急性毒性(LD50)及耐受量测定试验：取预先空腹12h的动物30只，随机分为3组，每组10只，各剂量组间间距为0.85。将千金藤素分别配成浓度为(2.0，1.7，1.4％)，然后给动物0.4ml·10g-1体重，1次ig，剂量为800mg·kg-1，观察1周，所有动物一般情况良好，无任何毒性反应及死亡。在此基础上进行1天内耐受量试验；另取动物20只，雌雄各半，禁食(不禁水)12h，然后按上法给动物1天2.0％的浓度ig两次，总量达1600mg·kg-1，，相当于人用量1.0mg·kg-1的1000倍以上，仅有少数动物出现少动，停止饮水和进食，持续2～3h后，即恢复正常，无动物死亡。表明，千金藤素对昆明种小鼠ig途径给药的耐受剂量为1600mg·kg-1。

②对大鼠的长期毒性实验：取大鼠60只，随机分为3组，每组20只，雌雄各半。(a)对照组：NS，20ml·kg-1，ig；(b)和(c)组为千金藤素组，剂量分别为40，80mg·kg-1，ig(相当于人用量的40，80倍)，每日1次，连用60d，ig；给药。在用药期间每日观察动物一般情况(活动、毛发、食量、大便等)，每10d称1次体重；在用药30d及60d时测定血象(白细胞总数及分类，血小板、红细胞、血色素)，肝肾功能，试验结束，处死各组部分动物，剖取主要脏器(心、肺、肝、脾、肾、肠、胃、睾丸、子宫)进行病理组织学检查。其结果为各组所有动物一般情况良好；大剂量组动物体重增长较慢，而对血象、肝肾功能及各主要脏器的病理组织学均无明显影响，与对照组相比，无差异。