人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(AFABP)ELISA试剂盒

背景^[1-3]

人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(AFABP)ELISA试剂盒可以特异性检测样本中人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(AFABP)的含量。

实验原理：人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(AFABP)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（elisa）。往预先包被人脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(aFABP)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(aFABP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(AFABP)ELISA试剂盒

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

应用^[4][5]

用于脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（FABP4）抑制心肌细胞收缩的机制研究

研究的数据表明,尽管结构与FABP3高度相似,但FABP4对心肌细胞收缩能力的抑制作用几乎不依赖于心肌细胞内钙释放的调控。由来自FABP4氨基末端的前20个氨基酸构成的FABP4衍生小肽（The first 20 amino acids from the N terminus of FABP4,FABP4-P20）同样能够以浓度依赖性的方式抑制心肌细胞的收缩,但是FABP4-P20却能够抑制小鼠心肌细胞钙瞬变,与FABP3类似。进一步鉴定了FABP4-P20中的关键氨基酸,发现E15K突变使FABP4-P20对于心肌细胞收缩的抑制作用降低了50%。

将为抗心衰药物的研发提供新的理论依据。

方法:1.实验动物本实验使用饲养于SPF级环境中的健康C57BL/6小鼠,12-14周龄。2.利用IonOptix单细胞动缘检测系统（IonOptix video-based edgedete-ction）检测细胞的收缩功能。3.通过钙成像技术研究小鼠心室肌细胞钙瞬变的动力学变化。4.统计学处理和相关分析。数据用MEAN±SE表示,采用SPSS 13.0软件进行统计学处理分析,检验以P<0.05为差异有显著性意义。

结果:1 FABP4抑制小鼠心室肌细胞兴奋-收缩偶联的特性。1.1 FABP4以剂量依赖性方式抑制小鼠心室肌细胞的细胞缩短幅度,曲线拟合数据提示FABP4对于心室肌细胞收缩的抑制有两个亲和力不同的作用机制。低亲和力机制的EC50为0.120 nmol/L,高亲和力机制的EC50约为0.010 pmol/L。

1.2 FABP4以剂量依赖性方式抑制小鼠心室肌细胞中的钙瞬变。1.2.1 FABP4抑制小鼠心室肌细胞的钙瞬变幅度,但仅在极高浓度下,EC50为0.412 nmol/L。1.2.2 FABP4抑制小鼠心室肌细胞的钙回收,但仅在极高浓度下,EC50为1.312 nmol/L。2 FABP4衍生小肽FABP4-P20抑制心室肌细胞收缩特性的研究。

2.1 FABP4-P20以剂量依赖的方式抑制细胞缩短。曲线拟合数据提示FABP4-P20对于心室肌细胞收缩的抑制只保留了低亲和力作用机制,EC50为0.110 nmol/L。2.2 FABP4-P20以剂量依赖的方式抑制小鼠心室肌细胞中钙瞬变幅度,与FABP4相比抑制作用升高约3倍,EC50为1.860 nmol/L。2.3 FABP4-P20以剂量依赖的方式抑制小鼠心室肌细胞中的钙回收,与FABP4相比抑制作用升高约7倍,EC50为1.564 nmol/L。2.4 E15K突变减弱FABP4-P20对细胞缩短的抑制约50%,表明氨基端第15位的谷氨酸对FABP4-P20的这种抑制功能至关重要。

结论:1.FABP4主要通过钙非依赖性途径抑制心肌细胞的收缩,且有两个亲和力不同的作用机制。2.FABP4衍生小肽FABP4-P20仅保留了FABP4的低亲和力抑制作用,但是显示出了与FABP3相似的抑制钙调控的作用。3.氨基端第15位的谷氨酸是FABP4-P20收缩抑制功能的关键位点。

参考文献

[1]An Overview and Update on Obesity and the Obesity Paradox in Cardiovascular Diseases[J].Andrew Elagizi,Sergey Kachur,Carl J.Lavie,Salvatore Carbone,Ambarish Pandey,Francisco Ortega,Richard V.Milani.Progress in Cardiovascular Diseases.2018

[2]Early Diagnostic Performance of Heart-Type Fatty Acid Binding Protein in Suspected Acute Myocardial Infarction:Evidence From a Meta-Analysis of Contemporary Studies[J].Li-Qian Xu,Yun-Mei Yang,Hong Tong,Chang-Fu Xu.Heart,Lung and Circulation.2018(4)

[3]Heart-type fatty acid binding protein is a sensitive biomarker for early AMI detection in troponin negative patients:a pilot study[J].Luisa Agnello,Giulia Bivona,Giuseppina Novo,Concetta Scazzone,Roberto Muratore,Piero Levantino,Chiara Bellia,Bruna Lo Sasso,Marcello Ciaccio.Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory I.2017(6)

[4]Heart-type fatty acid-binding protein as a diagnostic biochemical marker for early detection of myocardial infarction[J].Hamza,Demerdash,Ibrahim.Acta Cardiologica.2016(5)

[5]王翠华.脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（FABP4）抑制心肌细胞收缩的机制[D].河北医科大学,2019.