XIAP抗体的制备

背景^[1][2]

X连锁凋亡抑制蛋白(X—linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)属于IAP(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族之一，在1996年被有关学者等首次从人胚胎脑细胞中成功克隆，人体中仅有外周血淋巴细胞未见明显XIAP表达，其他组织中均可检测到XIAP。XIAP是IAP家族中作用最强的半胱氨酸～天冬氨酸蛋白酶抑制蛋白，主要由3个杆状病毒IAP重复序列区(Baculoviral inhibitor of apoptosis repeat，BIR)和1个RING锌指结构域组成。XAP基因是一种具有潜在价值的肿瘤标志物。

研究表明，骨肉瘤、前列腺癌、胰腺癌L、肝癌、白血病等疾病与XIAP的过表达有密切关系。研究表明，高表达XIAP蛋白的肿瘤组织对化疗药物的敏感性下降，是导致肿瘤对化疗药物产生耐药性的一个重要原因。关芳灵等 研究表明，XIAP表达下调可使细胞的增殖与凋亡达到相对平衡，并能使异常细胞及时得以清除，从而避免其向恶性肿瘤方向转化。

据此推测，XIAP可能在肿瘤的发生和发展中起着重要作用。快速制备效价高、特异性强的XIAP抗体，对于肿瘤的早期诊断和预防具有重要意义。XIAP表达与肿瘤患者生存预后密切相关，且其可作为判断肿瘤患者临床分期的重要标志。多克隆抗体具有特异性强、亲合力大、滴度高等特点，能够满足ELISA、Western blot、免疫组化试验等对抗体的要求。高效、快速制备多克隆抗体在生命科学研究中具有重要意义。

XIAP抗体(XIAP antibody)用人工合成的人XIAP氨基端一段多肽进行适当修饰后免疫rabbit，然后用protein A和抗原多肽亲和柱经过两步纯化得到的高纯度抗体。XIAP抗体识别的是总XIAP(total XIAP)，可以检测内源性的XIAP，未发现和其它凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein)有交叉反应。 XIAP抗体可用于Western blot。

有实验应用RT-PCR技术和TOPO克隆方法，成功构建了XP基因的原核表达载体pET151-XIAP，并系统研究了其原核表达的条件以及 NiNTA 亲和层析柱纯化方法；同时，采用常规免疫和耳静脉连续加强免疫方法在31 d内获得了XIAP多克隆抗体，为XIAP抗体的应用提供了原料，并且提供了一种快速制备多克隆抗体的免疫方法。

制备^[2]

1）动物免疫：将纯化后的XIAP重组蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合，充分进行乳化，使其终质量浓度为300>g/mL；然后按1 mL/只的剂量皮下多点注射免疫成年新西兰白兔2只。初次免疫后，将XIAP重组蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化后进行加强免疫，每2周1次，共免疫2次，每次免疫剂量为300/lg。

末次免疫3 d后，经耳静脉采血并分离上清液，用ELISA 法测定抗体血清的效价。免疫31 d后，对其中1只试验兔进行耳静脉注射加强免疫，连续免疫3 d，每次用量为600g重组蛋白，再用ELISA法测定抗体血清效价；待获得满意效价后，心脏采血分离抗体血清。

2）XIAP抗体效价的EI ISA检测：用0.05mol/L碳酸盐(pH 9.6)包被缓冲液将抗原蛋白XIAP稀释至含量为10 Itg/mL后，包被于聚苯乙烯板的反应孔中，并用含0.05 g/mI 脱脂奶粉的PBS缓冲液(pH 7.4)进行封闭，所用一抗为梯度稀释的兔抗XIAP血清，二抗为羊抗兔IgG—HRP酶标抗体(1：1 000)。再用TMB进行显色反应，酶标仪检测OD值，当试验孔OD 。值为阴性对照孔OD 。值的2.1倍以上时，即可判定为阳性。

3）XIAP抗体特异性的Western blot检测：取重组XIAP蛋白10/zg，利用12 SDS-PAGE电泳检测，然后进行转膜(6O V，1 h)，再以含0.05g/mL脱脂奶粉的TBS封闭PVDF膜，以1：100稀释的兔抗XIAP血清作为一抗，以1：5 000稀释的羊抗兔IgG-HRP作为二抗，最后用ECL法进行曝光。

采用Western blot方法对XIAP抗体的特异性进行检测，结果如下：

主要参考资料

[1] XIAP在胃癌组织中的表达及临床意义研究

[2] 张婷婷, 周光现, 王昕, 等. 人 XIAP 基因多克隆抗体的快速制备方法研究[J]. 西北农林科技大学学报: 自然科学版, 2011, 39(9): 7-12.