病毒DNA提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

病毒DNA提取试剂盒采用高效、专一结合核酸的离心吸附柱和缓冲系统，适合从血浆、血清和其它无细胞体液等样品中分离纯化病毒的DNA或者RNA，本试剂盒加入了Carrier RNA，可以从体系中轻松捕获微量核酸,具有方便快捷、产量高、重复性好的特点。所得病毒基因组DNA或RNA无蛋白、核酸酶或其它杂质的污染，可直接用于PCR、酶切、杂交、反转录等分子生物学实验。

病毒DNA提取试剂盒

产品特点：

快速纯化得到高质量病毒DNA和RNA。

无有机抽提或乙醇沉淀。

重复性强，产量高。

完全去除污染物和抑制剂，方便下游应用。

病毒是一类个体微小，结构简单，只含单一核酸，必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型微生物。病毒在自然界分布广泛，可感染人体细胞，在细胞内解体释放出核酸分子，借细胞内环境的条件以独特的生命活动体系进行复制，常引起人体发病。目前知道的DNA病毒有乙肝病毒，T2噬菌体，天花病毒，花椰菜花叶病毒等，病毒DNA提取试剂盒适用于所有的感染人类的血液中的病毒基因组DNA的提取，在已知的DNA病毒中，因为乙肝病毒对人类的影响和危害，传染性最强，因此病毒DNA提取试剂盒尤其适用于乙肝病毒基因组DNA的提取。

实验步骤：样品首先被蛋白酶K消化，随后加入适合DNA结合到纯化柱上的缓冲液，然后加入到纯化柱内。通过高速离心，使DNA在穿过纯化柱的瞬间，结合到纯化柱上，随后通过两次洗涤去除各种杂质，最后通过洗脱液把DNA洗脱下来。整个过程无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀，样品裂解后仅需约15分钟即可完成。

应用^[4][5]

用于核盘菌DNA病毒SsHADV-1的基因功能和入侵机制研究

探讨了病毒SsHADV-1的衣壳蛋白Cp和复制相关蛋白Rep在核盘菌中的生物学功能。利用真菌启动子PtrpC或EF-1α,获得了在核盘菌菌株Ep-1PNA367中超量表达Cp和Rep基因的转化子。两种类型的转化子中病毒的Cp和Rep基因可以单独或共同转录,但是均检测不到病毒蛋白翻译。阳性转化子在菌丝尖端形态、菌落形态、及产酸能力和致病力上均与菌株Ep-1PNA367不存在显著性差异。

此外,SsHADV-1病毒能通过菌丝融合自携带病毒的核盘菌水平传播至表达Cp和Rep转化子中,据此推测病毒Cp或Rep在核盘菌中超表达均不能抗病毒。利用SsHADV-1外壳蛋白Cp单克隆抗体对携带病毒菌株的总蛋白进行免疫沉淀反应,获得核盘菌中61个与病毒Cp互作的候选蛋白。

分析了SsHADV-1病毒粒子直接进入核盘菌菌丝的分子机制。通过高通量测序在转录水平上分析了病毒粒子侵染菌丝早期（1 h-3 h）的核盘菌差异表达基因,发现在核盘菌菌丝受SsHADV-1病毒粒子侵染后,共有187个基因显著差异表达,其中114个上调表达,73个下调表达。受病毒粒子侵染的差异表达基因主要参与到生物代谢、抗生素和次级代谢产物合成途径。

细胞结构分析表明有26%的差异基因与膜结构相关,且10个基因被预测定位于细胞膜上。30%有功能注释的基因预测参与Ras-small G蛋白信号转导途径。因此,推测SsHADV-1病毒粒子在侵染初期可能结合宿主膜蛋白,并在感染过程中通过Ras-small G蛋白偶联受体进行信号转导。明确了受病毒SsHADV-1侵染影响的核盘菌基因SS1G06180生物学功能。

利用SsHADV-1病毒粒子直接侵染核盘菌Ep-1PNA367的菌丝,处理3 h时基因SS1G06180显著下调表达。SS1G06180全长1498 bp,在核盘菌中功能未知,预测编码一种蛋白激酶,且含有多个phos-PKC类型磷酸化位点。该假定蛋白在5’端编码含有Macoilin家族蛋白的跨膜结构,此外含有编码Pal1的保守结构域,预测定位于细胞核内。

通过病毒水平传播,证明沉默基因SS1G06180的转化子具有抗DNA,+ssRNA和dsRNA真菌病毒的特性,与典型的RNAi和甲基化抗病毒机制不相同。分析沉默基因SS1G06180的转化子转录组测序结果,发现沉默转化子中酪氨酸和苯丙氨酸代谢、次级代谢产物合成和甘油酯代谢等通路受到影响。野生型核盘菌在PDA上生长第5 d（菌核原基形成）和第9 d（菌核成熟）时,SS1G06180表达量较高。

获得了敲除SS1G06180的转化子,其表型为菌落较白,菌核数量减少,单个菌核增大,致病力下降。黑色素与菌核形成相关,在敲除转化子中黑色素合成信号通路的聚酮合酶基因PKS13明显下调表达,小柱孢酮脱水酶基因SCD1和还原酶基因T4HN显著上调表达,推测SS1G06180在核盘菌中参与黑色素合成从而影响菌核发育。前期的研究发现SsHADV-1不能感染灰葡萄孢,但是本研究表明SsHADV-1病毒粒子虽然不能直接侵染灰葡萄孢健康菌丝,但是病毒粒子可以通过PEG介导感染3个不同的灰葡萄孢菌株,且病毒可以在灰葡萄孢菌丝中复制和增殖。

获得病毒SsHADV-1后的灰葡萄孢菌株B05.10-HADV平均生长速度为11 mm/d,显著低于不含病毒的灰葡萄孢B05.10（平均生长速度为14 mm/d）。菌株B05.10-HADV菌落异常,其分生孢子携带病毒SsHADV-1的概率为1/20。从菌株B05.10-HADV中提取的DNA病毒粒子裂解获得的病毒核酸与SsHADV-1有一个碱基的差别,在编码病毒Rep的2086位碱基由C（胞嘧啶）碱基突变为T（胸腺嘧啶）碱基,对应的氨基酸则由苏氨酸突变为丝氨酸。推测SsHADV-1的Rep区域单碱基突变可能造成了寄主范围的改变。

参考文献

[1]Enhanced hypovirus transmission by engineered super donor strains of the chestnut blight fungus,Cryphonectria parasitica,into a natural population of strains exhibiting diverse vegetative compatibility genotypes[J].Cameron M.Stauder,Donald L.Nuss,Dong-Xiu Zhang,Mark L.Double,William L.MacDonald,Amy M.Metheny,Matthew T.Kasson.Virology.2019

[2]Correction to:Smacoviridae:a new family of animal-associated single-stranded DNA viruses[J].Arvind Varsani,Mart Krupovic.Archives of Virology.2018(11)

[3]Deficiency of the melanin biosynthesis genes SCD1 and THR1 affects sclerotial development and vegetative growth,but not pathogenicity,in Sclerotinia sclerotiorum[J].Yue Liang,Wei Xiong,Siegrid Steinkellner,Jie Feng.Molecular Plant Pathology.2018(6)

[4]Molecular characterization of a novel mycovirus in Alternaria alternata manifesting two-sided effects:Down-regulation of host growth and up-regulation of host plant pathogenicity[J].Ryo Okada,Shun Ichinose,Kana Takeshita,Syun-ichi Urayama,Toshiyuki Fukuhara,Ken Komatsu,Tsutomu Arie,Atsushi Ishihara,Mayumi Egusa,Motoichiro Kodama,Hiromitsu Moriyama.Virology.2018

[5]丁峰.核盘菌DNA病毒SsHADV-1的基因功能和入侵机制研究[D].华中农业大学,2019.