生孢梭菌的应用

背景^[1][2]

2013 年 8 月 3 日，国际食品安全当局网络通报了“新西兰乳制品企业在浓缩乳清蛋白粉中检出肉毒梭菌” 的消息，新西兰某企业在接受客户请求检测肉毒毒素的过程中，从其生产的浓缩乳清蛋白粉中检出产芽孢微生物，其代谢产物显示了对实验动物毒性，由此怀疑乳清蛋白粉产品中可能受到肉毒梭菌污染，并上报新西兰政府部门，由此引发全球范围内该企业生产的问题乳清蛋白粉及用问题乳清蛋白粉生产的乳制品大批量召回，受污染的芽孢微生物后经鉴定为生孢梭菌 ( Clostridiumsporogenes)。

生孢梭菌和肉毒梭菌 ( Clostridiumbotulinum) 在生化特征、遗传学特性方面非常相似，二者的区别在于生孢梭菌不会产生肉毒毒素。有报道生孢梭菌也可以产生不同于肉毒毒素的其他有毒代谢产物。生孢梭菌属于 亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌（SRC），为一群厌氧、过氧化氢酶阴性、能将亚硫酸盐还原为硫化物的革兰氏阳性梭状芽孢杆菌，其孢子广泛分布于自然界，通常存在于人和动物的粪便、废水和土壤中，代表性菌种除了生孢梭菌外，还包括致黑梭状芽胞杆菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌等。

因此，生孢梭菌通常以生孢梭菌的形式作为评估食品、食品加工设备及食品生产环境等微生物污染指示菌，不认为其有致病性。0.5毫升菌液1:10接种于新的疱肉培养基中，过夜培养。然后再1:10接种于两瓶20毫升新的疱肉培养基中培养。第1瓶培养12-16h，至细菌增殖处 于 对 数期，生长旺盛，生成大量繁殖体。第2瓶培养6-10d，至细菌增殖处于静止期，生成大量芽胞。

生孢梭菌分离后，第1瓶培养的第1天，生孢梭菌即进入对数生长期，细菌增殖旺盛，革兰染色可见大量的革兰阳性的粗大杆菌。第2 瓶培养的第２天即开始生成芽胞，随着培养时间的延长，芽胞所占比例越来越大，但是芽胞内一直混有繁殖体。图所示为生孢梭菌培养第6天的染色结果，可见有部分细菌生成椭圆形、不易着色的芽胞，有的芽胞已经从菌体上脱落。

应用^[3][1]

生孢梭菌是一种靶向性好、安全性高、具有自限性的实体瘤靶向载体。由于尾静脉注射与瘤内直接注射，注射芽胞与注射繁殖体产生的效果并无明显区别。研究结果证实，尾静脉注射与瘤内注射一样，生孢梭菌可以准确定位于实体瘤内低氧坏死区并生长繁殖，虽然静脉注射后生孢梭菌可以通过血流到达肝、脾、肾等正常器官，但是并没有数量上的增长，且随着时间的推移而很快被由体内清除，对正常器官没有不良影响。

由于实际上大多数肿瘤都不可触及，从而使得瘤内注射受限，因此静脉注射显得比较实际，通过静脉注射，可一次性到达体内所有的实体瘤内部。研究显示，小鼠在肿瘤消褪前，肿瘤内部进入大量的中性粒细胞，吞噬消除了生孢梭菌。这是因为当肿瘤变得很小时，大量中性粒细胞得以通过供应肿瘤的血管进入肿瘤内部，并发挥正常功能；这在肿瘤较大时也有发生，但是中性粒细胞的吞噬作用相比生孢梭菌的旺盛繁殖力显得微不足道。

使用生孢梭菌治疗裸鼠的人结肠癌肿瘤 HCT116肿瘤时，曾给予抗生素以消除生孢梭菌。我们认为对于具有正常免疫力的动物所携带肿瘤的治疗中，在注射生孢梭菌后，可以不必使用抗生素清除。

此外，生孢梭菌孢子对物理和化学因子抵抗力较强，因此在水体微生物检测中常被作为受动物排泄物污染和过程控制指标。生孢梭菌最初被作为致病性梭状
芽孢杆菌污染的指标菌提出来，目的是判断食品，尤其是罐头食品和婴幼儿配方食品是否被不同来源的梭状芽孢杆菌(如粪便来源的产气荚膜梭菌和土壤来源的肉毒梭菌) 污染。

由于此类细菌芽孢抵抗力强，可在加工不当的食品中存活，适宜条件下又可生长繁殖而造成食品品质降低或腐败，甚至引起食物中毒，因此目前越来越多地将生孢梭菌用于指示食品被粪便污染、加工环境卫生状况控制、食品生产过程控制指标，以监测产芽孢厌氧菌的潜在生长和存活力。

但到目前为止，绝大多数国家和国际组织未将生孢梭菌作为常规检测项目列入乳与乳制品的安全控制。根据已有资料，在乳制品中设 置生孢梭菌强制性限量标准的国家仅 有俄罗斯和阿尔及利亚。美国乳品出口协会提出 10～25 cfu /g的建议限量值。

毒性^[3]

生孢梭菌代谢产物对 ICR小鼠的毒性研究尽管目前尚未见报道称生孢梭菌可引起婴幼儿和成人的食物中毒，但 2010 年从 9份市售的婴幼儿配方粉中的 7 份检测到梭菌的孢子，经鉴定主要为生孢梭菌。针对此次国际食品安全当局网络通报的“新西兰乳制品企业在浓缩乳清蛋白粉中检出肉毒梭菌” 的情况，2013 年 8 月 23日，国际食品微生物标准委员会与国际微生物学联合会就婴幼儿配方粉和婴幼儿配方粉用基粉中检测肉毒梭菌的科学性进行评估时，提出不建议将肉毒梭菌列入婴幼儿配方粉和婴幼儿配方粉用基粉的常规检测项目，但当产品存在受肉毒梭菌孢子污染的风险时，可检测 SRC。

鉴于 SRC 污染水平可用于判断浓缩乳制品或产品 如婴幼儿配方粉) 生产过程是否遵循良好卫生和生产操作。如果 SRC 超过 100 cfu /g，说明生产条件可能有利于厌氧微生物的繁殖，或指示有外源性污染，应对可能存在的污染原因进行调查并采取必要的措施降低污染。

通常认为生孢梭菌不具有致病性，但有研究报道，从出血性腹泻的兔中分离到一株可产生出血毒素的生孢梭菌，提纯的毒素可以水解 III 型和 IV 型胶原，也能水解由 I 型、II 型、III 型和 IV 型胶原生产的明胶。表明生孢梭菌产生的毒素具有胶原酶的活性，可以水解 III 型和 IV型胶原是血管壁内膜的组成成分，从而破坏血管壁的结构，引起出血，进一步的究表明该毒素直接作用在兔肠道血管壁的内皮细胞，但对小鼠、大鼠和豚鼠则不显示毒性作用。

主要参考资料

[1] 董银苹, 韩春卉, 江涛, 等. 生孢梭菌代谢产物对 ICR 小鼠的毒性研究[J]. 中国食品卫生杂志, 2014, 26(5): 414-417.

[2] 熊海元, 崔强. 生孢梭菌孢子作为生物指示剂的研究[J]. 中国医药工业杂志, 2003, 34(7): 354-356.

[3] 张艳丽, 苏昊, 胡昊宇, 等. 生孢梭菌作为肿瘤基因治疗载体应用方式与动态分布[J]. 青岛大学医学院学报, 2013 (6): 476-478.