胆固醇氧化酶的提取纯化方法及用途

概述^【2】

胆固醇氧化酶在食品工业、制药工业和生物农业中都有广泛的用途。现以胆固醇氧化酶在蛋制品加工中的应用对经济效益进行分析为例，目前我国蛋制品已达年产8000万吨左右，蛋的营养丰富，可以从中提取许多附加值高的产品，如免疫球蛋白，蛋黄卵磷脂，唾液酸等；而提取剩下的蛋黄粉，尽管蛋白质含量较高，但由于富含胆固醇而得不到消费者的垂青，造成每年大约4万吨蛋黄的滞消，带来巨大的资源损失和浪费。

而事实上，蛋黄粉是目前食品领域主要的营养强化剂，如用本产品处理蛋黄粉以生产低胆固醇产品，则市场需求食品级胆固醇氧化酶每年约200吨。同时，随着我国人口老龄化的进程加快，人体中由胆固醇偏高引起的老年性疾病不断增多，愈来愈要求对肉制品、奶制品中的胆固醇进行处理以降低含量，市场需求也在100吨左右。胆固醇氧化酶在食品中应用的推广，可以改善食品质量，优化膳食结构，保证人民的身体健康。

在试剂用酶方面，较大的试剂生产厂家如北京中生、潍坊3V、上海科华试剂公司和温州东瓯生物工程有限公司每年要大量进口试剂级胆固醇氧化酶。本产品的推出，可以为生产厂家节省外汇，大大降低试剂生产成本，也有利于推动和扩大胆固醇试剂盒的应用和生产。

主要用途^【1】

1. 胆固醇氧化酶应用于检测血清或食品中胆固醇含量，与胆固醇脂酶复配，就可以制造临床诊断试剂盒，具有较大的应用市场。

2. 胆固醇氧化酶可以降解食品中的胆固醇，在降低胆固醇的同时产生胆甾―4一烯―3―酮，这可以替代化学法和物理法生产低胆固醇保健食品。

3. 胆固醇氧化酶可以破坏内消化道上皮细胞，抑制昆虫生长发育，是一种有效的杀灭鳞翅目昆虫的杀虫剂。

4. 胆固醇氧化酶催化氧化胆固醇生成的胆甾―4一烯―3―酮具有降低血脂、防止皮肤角质化以及抗肥胖的功能。胆甾―4一烯―3―酮也可以作为激素类或其它药物的前体物质。

作用机理和酶活测定方法^【1】

胆固醇氧化酶对胆固醇的催化作用有两步: 氧化和异构化, 首先胆固醇氧化酶将胆固醇3 位上的羟基氧化生成羰基.即中间产物五烯三酮, 然后将5 位上的烯烃双键异构成4 位上的烯烃双键, 即终产物胆甾烯酮, 同时将脱下的氢与氧气生成H202。

测定胆固醇氧化酶活性的方法有很多种如: 胆甾酮分析法、过氧化氢分析法、液相色谱法和薄层层析法等。其中过氧化氢法比较简单, 所需的仪器比较少, 是常用的一种方法。

它的反应机理如下：

胆固醇在胆固醇氧化酶的催化下, 生成胆甾- 4- 烯-3- 酮( cholest- 4- en- 3- one) 和过氧化氢。过氧化氢、4- 氨基- 安替比林( 4- Aminoantipyrine) 与苯酚( Phenol) 在过氧化物酶( peroxidase) 的催化下生成亚醌类红色化合物(Quinoneimine dye)。

胆固醇氧化酶的催化反应过程中, 氧化1mol 胆固醇，产生1mol 过氧化氢。比色法是依据过氧化氢在辣根过氧化物酶的作用下分解, 可使反应体系中的4- 氨基- 安替比林与苯酚形成的红色亚醌类化合物在500nm 出有吸收峰的原理, 通过测量反应液在500nm 的吸光度, 就可以定量测定胆固醇被氧化的量, 从而计算出胆固醇氧化酶的酶活。胆固醇氧化酶酶活单位定义为: 1 分钟氧化1!mol胆固醇的量, 即生成1!mol 过氧化氢的量。对比过氧化氢浓度标准曲线就能求出相应胆固醇氧化酶的酶活。

提取^【1】

用诺卡氏菌(Nokarolia sp．NCIB 10554)发酵提取。

发酵：

培养基成分：(NH4)2SO42．0g／L，CaCl2·2H20 0．01g／L，FeS04·7H20 0．01g／L，K2HP042．Og／L，MgSOt·7H20 0，2g／L，甘油lOg／L，酵母浸膏20g／L，pH6．7，种子培养及生长培养均用此培养基。

将几经发酵的种子菌接种到500L发酵培养液中，于30℃发酵24小时，转速250rpm，通气量为150L／min，以聚丙二醇作消泡剂。在发酵14小时，培养基中菌体可达1～2g湿重／L，加入2L胆固醇(600g)、吐温80(60mg)水溶液，24小时后菌体浓度达6～7g温重／L，离心收菌。

提取：

将菌体悬于0．01mol／L，pH7．0的磷酸钾缓冲液中，内含0．5％(v／v)Triton X一100，最终体积为60L(10℃)，轻轻搅拌2小时，去除细胞碎片。

纯化^【1】

上清液于5℃过DE一52柱(容积5L，先与0．01mol／L pH7．0之磷酸钾缓冲液平衡，内含0．5% Triton X一100)。再过一次DE一52柱，将磷酸钾浓度逐级提高，这可将内含之过氧化氢酶分离掉。将富含胆固醇氧化酶的成分超滤浓缩达5U/ml，经亲和层析得比活为25U/mg的酶。一般商品酶的比活为25U/mg，配制试剂盒的比活要求为20U/mg。

参考文献

[1]唐伟国主编,医学检验诊断试剂的制备与应用,上海科学技术文献出版社,1996年10月第1版,第70页

[2]中国化工学会生物化工专业委员会,生物基化学品（以工业生物技术制备化学品）技术成果交流文集,第150页