胆碱/乙酰胆碱检测试剂盒的应用

背景^[1-3]

胆碱乙酰胆碱检测试剂盒提供了一种简单、高灵敏的方法来定量检测各种生物学标本中胆碱和乙酰胆碱的含量。试剂盒基本原理如下：游离的胆碱可被甜菜碱醛氧化成甜菜碱（βine），反应产物可与胆碱探针相互作用产生颜色或者荧光，从而可被普通酶标仪（570 nm）或者荧光计检测(Ex/Em=535/587 nm)检测到。乙酰胆碱则可先使用乙酰胆碱酯酶转换成胆碱，然后再进行检测。试剂盒适用于多种类型标本：血液、细胞、培养基、发酵培养基等，而不需要对标本进行前期处理或纯化。试剂盒可检测到10 pmol~5 nmol的胆碱或乙酰胆碱。

胆碱乙酰胆碱检测试剂盒

胆碱是一种强有机碱，是卵磷脂的组成成分，也存在于神经鞘磷脂之中，是机体可变甲基的一个来源而作用于合成甲基的产物，同时又是乙酰胆碱的前体。乙酰胆碱（AcetylCholine,ACh）是一种神经递质，能特异性的作用于各类胆碱受体，在组织内迅速被胆碱酯酶破坏，其作用广泛，选择性不高。在神经细胞中，乙酰胆碱是由胆碱和乙酰辅酶A在胆碱乙酰移位酶（胆碱乙酰化酶）的催化作用下合成的。胆碱和乙酰胆碱在许多生物学过程中发挥重要的作用。

乙酰胆碱，是一种神经递质。在组织内迅速被胆碱酯酶破坏。乙酰胆碱能特异性地作用于各类胆碱受体，但其作用广泛，选择性不高。临床不作为药用，一般只做实验用药。在神经细胞中，乙酰胆碱是由胆碱和乙酰辅酶A在胆碱乙酰移位酶（胆碱乙酰化酶）的催化作用下合成的。主流研究认为人体内该物质含量增多与阿尔兹海默病（老年痴呆症）的症状改善显著相关。

应用^[4][5]

用于猪脑乙酰胆碱酯酶的分离纯化及性质和功能基团研究

神经递质乙酰胆碱及胆碱能系统,即乙酰胆碱合成的酶系、两类乙酰胆碱受体和乙酰胆碱酯酶等,广泛存在于动植物体内,并参与一些重要生理过程的调节。乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）是一类水解酶,在动物神经传导中起重要作用,能高效地将神经递质乙酰胆碱水解为乙酸和胆碱,从而保证神经冲动在突触间的正常传导。乙酰胆碱酯酶还具有非催化功能,参与细胞的发育和成熟,参与细胞迁移、粘附和凋亡,促进神经元发育和神经再生,促进造血细胞形成以及影响炎症和免疫反应。

以来源广泛、廉价的猪脑为材料,对乙酰胆碱酯酶进行了分离纯化以及部分酶学性质的研究,以期为该酶的来源及进一步研究和猪脑的综合开发利用提供科学参考。

其结果如下：1.猪脑乙酰胆碱酯酶的分离纯化以新鲜猪脑为原材料,经过匀浆离心、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析,分离纯化获得电泳纯乙酰胆碱酯酶。比活力2.05U/mg,纯化倍数为26.97倍,酶活回收率为11.95%。

2. 猪脑乙酰胆碱酯酶的性质研究猪脑乙酰胆碱酯酶全酶相对分子量257.30kD,亚基相对分子量66.94kD,推测该酶由四个相同亚基组成。该酶催化碘化硫代乙酰胆碱最适温度为37℃,最适pH为7.4,该酶在40℃以下,酶活力保持稳定,在pH6.0～8.0范围内较稳定；该酶的底物是碘化硫代乙酰胆碱；当底物浓度超过4.0mmol/L时,表现出过量底物抑制现象,该酶的表观Km为0.94mmol/L。

3. 有机溶剂、化合物及金属离子对猪脑乙酰胆碱酯酶的影响乙醇、异丙醇、SDS、过氧化氢、抗坏血酸、草酸和脲素对猪脑乙酰胆碱酯酶有明显的抑制作用；低浓度的EDTA-Na2对该酶则表现出一定的激活作用；浓度较低的Mg2+对该酶表现出激活作用,Ba2+和Zn2+对该酶有强烈的抑制作用。

4.猪脑乙酰胆碱酯酶功能集团的研究采用化学修饰剂对该酶的功能基团进行修饰,结果表明：半胱氨酸巯基、甲硫氨酸残基、组氨酸咪唑基和丝氨酸残基可能是猪脑乙酰胆碱酯酶活性中心的必需基团,参与了该酶活性中心的构成。二硫键可能是维持猪脑乙酰胆碱酯酶活性所必需的基团。而精氨酸胍基、酪氨酸酚羟基、赖氨酸残基和色氨酸残基可能不是该酶活性中心的必需基团,并不参与该酶活性中心的构成。

参考文献

[1]Expression and characterization of recombinant Locusta migratoria manilensis acetylcholinesterase 1 in Pichia pastoris[J].Xiaoxia Zhou,Yuxian Xia.Protein Expression and Purification.2010(1)

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[3]Recombinant expression and biochemical characterization of the catalytic domain of acetylcholinesterase-1 from the African malaria mosquito,Anopheles gambiae[J].Haobo Jiang,Siwei Liu,Picheng Zhao,Carey Pope.Insect Biochemistry and Molecular Biology.2009(9)

[4]Cloning and expression of carp acetylcholinesterase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme[J].Ryohei Sato,Toru Matsumoto,Norio Hidaka,Yasuko Imai,Katsumasa Abe,Shouji Takahashi,Ryo-hei Yamada,Yoshio Kera.Protein Expression and Purification.2008(2)

[5]王洁.猪脑乙酰胆碱酯酶的分离纯化及性质和功能基团研究[D].西南大学,2014.