大鼠骨髓间充质干细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠骨髓间充质干细胞是从成年大鼠骨髓组织中分离得到的，原代冻存，冰冻运输。每管细胞密度超过5×10^5/ml。骨髓间充质干细胞经免疫荧光鉴定、和CD73，CD90，CD105的抗体鉴定，以及分化后的脂质染色鉴定。本细胞经检测不含支原体、细菌、酵母菌和真菌。

间充质干细胞是一类很有特性的细胞。它们有发育为成熟细胞的潜在能力而产生脂肪、软骨、骨骼和肌肉。它们发育中的可塑性使人们对用间充质干细胞来替换受损组织的潜在能力产生了极大的兴趣。间充质干细胞无血清培养，在转化生长因子作用下会分化成软骨细胞。相反，在有血清、抗坏血酸和地塞米松的作用下会分化成成骨细胞。间充质干细胞有潜能呗移植到受伤的部位或者种植到仿生支架上生长形成适当的组织结构。

大鼠骨髓间充质干细胞

干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”，干细胞的增殖保证了机体内的动态平衡。

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓基质中的非造血干细胞，能在体外或体内分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。源于自体骨髓的间质干细胞能够很好地避免异体间移植的免疫排斥反应，在临床上，已经成功地将骨髓间充质干细胞移植到患者体内，用于治疗骨组织缺损和心肌梗塞等疾病。

细胞传代

待细胞融合至80%~90%开始传代，吸去培养液，以预热的PBS轻轻冲洗后，吸去PBS。采用消化液消化1-2分钟，骨髓干细胞贴壁特性强，比较难于消化，消化液可采用提高EDTA浓度的方法，镜下可见细胞皱缩变圆，终止消化。本实验的消化液配方可以很好地消化，并不会损伤细胞。除消化液特殊外，其他方法同本光盘内的细胞传代方法。

应用^[4][5]

用于SDF-1/CXCR4轴以及MCP-1/CCR2轴对小鼠骨髓间充质干细胞迁移及归巢的影响研究

培养了ICR小鼠的骨髓间充质干细胞,建立ICR小鼠心肌梗死模型,分选骨髓间充质干细胞中CXCR4和CCR2表达阳性的细胞,研究其归巢和迁移能力的差异,对小鼠梗死心肌修复的影响,并对PI3K/Akt通路在该归巢效应中的潜在作用进行了初步探讨。

方法：1.无菌条件下取5-8周龄ICR小鼠的胫腓骨,体外全骨髓贴壁法培养,80%铺满后进行传代,流式鉴定细胞表面分子表达以及细胞周期,G0/G1期细胞量较多,CD44、CD90、CD105阳性率较高的细胞符合骨髓间充质干细胞特征。

2. 气管插管辅助3、4肋间开胸结扎冠状动脉下支的方法建立小鼠心梗模型,检测LVEF、FS、LVEDD等指标,鉴定小鼠模型是否构建成功。

3. 小鼠骨髓间充质干细胞体外培养扩增联合免疫磁珠分选（MACS）纯化CXCR4/CCR2阳性骨髓间充质干细胞,并作克隆培养,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞分选前后的细胞表面标志物的表达情况。

4. 采用Transwell模型检测CXCR4/CCR2对骨髓间充质干细胞迁移的影响及其可能机制。下室种植心肌细胞,上室为纯化的骨髓间充质干细胞。实验共分为四组,对照组,CXCR4+/CCR2+组,CXCR4+/CCR2-组,CXCR4-/CCR2+组,24h后5个高倍视野计数迁移的细胞。免疫荧光检测下室穿过细胞。

5. 左冠脉前降支（LAD）结扎建立小鼠心梗模型后,在梗死区周边选取5个位点注射分选后的细胞,观察移植骨髓间充质干细胞对体内归巢及对心梗修复的影响。实验共分为7组：假手术组（sham组）：开胸,不作冠脉前降支（LAD）结扎也不作干细胞移植；心梗组（MI组）：结扎LAD制造心梗,但不作其它处理；PBS对照组（empty组）：结扎LAD,梗死周边区注射PBS;CXCR4+/CCR2+组：结扎LAD,梗死周边区注射CXCR4+/CCR2+骨髓间充质干细胞,共选5个位点注射,每次注射30u1,细胞浓度2×106个/ml;CXCR4+/CCR2-组：结扎LAD,梗死周边区注射CXCR4+/CCR2-骨髓间充质干细胞,共选5个位点注射,细胞数量同上；CXCR4-/CCR2+组：结扎LAD,梗死周边区注射CXCR4-/CCR2+骨髓间充质干细胞,共选5个位点注射；CXCR4-/CCR2-组：结扎LAD,梗死周边区注射CXCR4+/CCR2+骨髓间充质干细胞,共选5个位点注射,3周后检测梗死周边进行干细胞注射的对照组和细胞组CM-dil标记的间充质干细胞向梗死区迁移的情况（n=5）。

6.归巢到梗死区的骨髓间充质干细胞分化情况采用免疫荧光检测。检测从周边迁移到梗死区的CM-dil标记的骨髓间充质干细胞的数量,每个心脏标本,梗死区随机取10个高倍视野,计算CM-DIL阳性细胞的比例。

参考文献

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[4]CXCR4-overexpressing bone marrow-derived mesenchymal stem cells improve repair of acute kidney injury[J].Nanmei Liu,Andreas Patzak,Jinyuan Zhang.AJP:Renal Physiology.2013(7)

[5]王宜青.SDF-1/CXCR4轴以及MCP-1/CCR2轴对小鼠骨髓间充质干细胞迁移及归巢的影响[D].苏州大学,2014.