小鼠睾丸间质细胞瘤细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠睾丸间质细胞瘤细胞是从C57BL/6小鼠移植的M548OP Leydig细胞肿瘤中建立。它保留了原始肿瘤对的反应。在人绒毛膜促性腺(hCG)、黄体、霍乱毒素、氟化钠和脒基-5'-ylimidodiphosphate处理下膜腺苷酸环化酶活性提高，在hCG作用下还可生成黄体酮。

小鼠睾丸间质细胞瘤细胞

细胞培养操作规程：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640＋10%FBS＋1%P/S；

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于氯化锰对小鼠睾丸间质瘤细胞凋亡及Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的影响研究

利用MA-10小鼠睾丸间质瘤细胞（MA-10 mouse Leydig tumor cells,mLTC-1）作为模型,观察MnCl2对睾丸间质细胞增殖的影响,并通过细胞凋亡及参与凋亡调控的Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表达水平的检测,初步了解其作用机制,为进一步研究其雄性生殖和发育毒性机制提供依据。

方法1.MnCl2对mLTC-1细胞活性的影响:采用MTT比色法将对数生长期的mLTC-1细胞以4×104/ml接种于96孔板上。A:分别加入含不同浓度MnCl2(0、10-7、10-6、10-5、10-4和10-3mol/L)的培养液对细胞染毒,培养24h;B:分别加入含不同浓度MnCl2（0、0.1、0.3、0.5、0.7和0.9 mmol/L）的培养液对细胞染毒,分别培养12h、24h、36h和48h。每个浓度设8个复孔,在酶标仪上测各孔OD值,确定染毒剂量和时间。

2.TUNEL凋亡细胞原位检测法检测细胞凋亡:将对数生长期的mLTC-1细胞以4.0×104/ml、每孔2ml接种于内含盖玻片的6孔培养板中,分别加入含不同浓度MnCl2（0、0.3、0.5和0.7 mmol/L）的培养液染毒,24h取出爬片,TUNEL法检测细胞凋亡。

3.mLTC-1细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表达水平:采用RT-PCR法将铺满瓶底80%左右的mLTC-1细胞分别加入含不同浓度MnCl2（0、0.3、0.5和0.7 mmol/L）的无FBS的培养基,培养24h后,提取RNA,以β-actin基因为内参照,运用半定量RT-PCR技术检测各个染毒组MnCl2对mLTC-1细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表达。

结果1.MTT结果显示:A:10-5mol/L～10-7mol/L的MnCl2处理组对mLTC-1细胞活性没有明显的影响;而10-4mol/L和10-3mol/L能明显抑制细胞的增殖,且与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。B:不同浓度的MnCl2作用24h后细胞的抑制率明显大于12h,差异有统计学意义（P＜0.05）;24h、36h和48h细胞抑制率的差异无统计学意义（P＞0.05）。

2. TUNEL细胞原位检测结果显示:0.3、0.5和0.7 mmol/L MnCl2作用24h,各个染毒组凋亡指数与对照组相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）。0.5和0.7mmol/L染毒组凋亡指数均高于0.3mmol/L染毒组,差异均有统计学意义（P＜0.05）;0.5和0.7mmol/L染毒组的凋亡指数相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。

3.半定量RT-PCR结果显示:MnCl2染毒组的Bcl-2 mRNA的表达量低于对照组表达量,且差异有统计学意义（P＜0.05）。MnCl2染毒组的Bax和Caspase-3mRNA的表达量显著高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。

参考文献

[1]Cadmium-induced testicular injury[J].Erica R.Siu,Dolores D.Mruk,Catarina S.Porto,C.Yan Cheng.Toxicology and Applied Pharmacology.2009(3)

[2]Disuse and orchidectomy have additional effects on bone loss in the aged male rat[J].S.Blouin,Y.Gallois,M.F.Moreau,M.F.Baslé,D.Chappard.Osteoporosis International.2007(1)

[3]Induction of apoptosis by 25-hydroxycholesterol in adult rat Leydig cells:Protective effect of 17β-estradiol[J].Carine Travert,Serge Carreau,Dominique Le Goff.Reproductive Toxicology.2006(4)

[4]Nicotine induces apoptosis in TM3 mouse Leydig cells[J].Khae-Hawn Kim,Kwan-Joong Joo,Heung-Jae Park,Chil-Hun Kwon,Mi-Hyeon Jang,Chang-Ju Kim.Fertility and Sterility.2005(4)

[5]杨雯雯.氯化锰对小鼠睾丸间质瘤细胞凋亡及Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的影响[D].郑州大学,2009.