PK-15细胞的应用

背景^[1-3]

PK-15细胞是由Stice·E建系于1955年；PK-15细胞是PK-1a细胞的克隆系，PK-15细胞可用于多种病毒的增值及特性研究。另外，电镜观察发现，PK-15细胞内有C-型病毒颗粒存在，是研究C-型病毒的材料。

PK-15(猪肾细胞)是来源于成年猪肾脏上皮细胞样贴壁细胞，生长培养基：MEM＋10%FBS＋1%P/S，培养条件气相：空气，95%；CO2，5%，温度：37℃。

PK-15细胞

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于PK-15细胞与三种益生菌共培养抗TGEV作用及IFN-γ、IL-6mRNA表达研究

在体外PK-15细胞与益生菌共培养模型中,通过台盼蓝染色检测不同益生菌菌体浓度和不同共培养时间组合条件下PK-15细胞的存活率,结果表明:不同的益生菌菌体浓度、不同的共培养时间,PK-15细胞的存活率不同。

当c≤108 CF U/m L且t≤24 h时,P K-15细胞的存活率较高,达90%以上;当c≤1012 CF U/m L且t≤3h时,P K-15细胞的存活率可达80%以上,即在上述两种情况下,PK-15细胞与益生菌共培养成立。

用MTT比色法检测不同浓度的益生菌与PK-15细胞共培养3 h及浓度均为108 CF U/m L的益生菌与PK-15细胞共培养不同时间,其共培养的抗TGEV效果,结果表明:在PK-15细胞与益生菌共培养体系中,当益生菌的浓度约为108 CF U/m L及当共培养时间延长到12 h左右对TGEV的抑制率较高,因此108 CF U/m L为益生菌的浓度,12 h为P K-15细胞与益生菌共培养的时间,并且两种情况下,对TGEV的抑制程度均为:枯草芽孢杆菌共培养组>屎肠球菌共培养组>食淀粉乳杆菌共培养组。

浓度为108 CF U/m L的益生菌与P K-15细胞共培养12 h后接种TGEV,检测不同时间点TGEV滴度,其半数组织培养感染剂量负对数的变化曲线随时间的增加,呈先上升后下降的趋势。

在PK-15细胞与枯草芽孢杆菌共培养体系中,当收集TGEV时间点为48 h时,其半数组织培养感染剂量的负对数达到峰值为3.87;在PK-15细胞与屎肠球菌共培养体系中,当收集TGEV时间点为24 h时,其半数组织培养感染剂量的负对数达到峰值为5.16;在PK-15细胞与食淀粉乳杆菌共培养体系中,当收集TGEV时间点为48 h时,其半数组织培养感染剂量的负对数达到峰值为4.55。在共培养体系中,每个处理组的TGEV的平均滴度均小于正常病毒组,因此PK-15细胞与益生菌共培养能降低TGEV的滴度,降低程度为:枯草芽孢杆菌组>屎肠球菌组>食淀粉乳杆菌组。

将六孔细胞培养板铺满单层的PK-15细胞进行如下分组处理:正常细胞对照组（Control组）、TGEV感染组（TGEV组）、与浓度为108 CF U/m L枯草芽孢杆菌共培养12 h组（BS+Cell组）和与浓度为108 CF U/mL枯草芽孢杆菌共培养12 h后感染TGEV组（BS+Cell+TGEV组）然后分别在1 h、3 h、6 h、12 h、24 h收集PK-15细胞样品实时荧光定量PCR检测不同时间点各组PK-15细胞中IFN-γ和IL-6 mRNA表达量的变化,结果表明:PK-15细胞与枯草芽孢杆菌共培养后感染TGEV能刺激IFN-γ和IL-6 m RNA表达量增加,作用效果为先快速增加,后逐渐减小。

BS+Cell+TGEV组在3 h、6 h时均显著刺激IFN-γm RNA表达量增加,在1 h、3 h时均能显著刺激IL-6 m RNA表达量增加,在3 h时IFN-γ和IL-6mRNA表达量达到值。

参考文献

[1]Oral administration of L actobacillus brevis KB 290 to mice alleviates clinical symptoms following influenza virus infection[J].N.Waki,N.Yajima,H.Suganuma,B.M.Buddle,D.Luo,A.Heiser,T.Zheng.Lett Appl Microbiol.2014(1)

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[3]Antiviral effects of a probiotic Enterococcus faecium strain against transmissible gastroenteritis coronavirus[J].Weidong Chai,Michael Burwinkel,Zhenya Wang,Christiane Palissa,Bettina Esch,Sven Twardziok,Juliane Rieger,Paul Wrede,Michael F.G.Schmidt.Archives of Virology.2013(4)

[4]Enhanced chondrogenesis in co-cultures with articular chondrocytes and mesenchymal stem cells[J].Ville V.Meretoja,Rebecca L.Dahlin,F.Kurtis Kasper,Antonios G.Mikos.Biomaterials.2012(27)

[5]刘文娜.PK-15细胞与三种益生菌共培养抗TGEV作用及IFN-γ、IL-6mRNA表达[D].东北农业大学,2016.