雌二醇的制剂方法和制备方法

背景及概述^[1-2]

雌二醇[17β-雌二醇或雌-1，3，5(10)-三烯-3，17-二醇，(17-β)]或E2是分子量为272.38道尔顿的C18甾体激素。它是性激素，称为“雌性”激素(也存在于雄性中)，其是一组内源甾体中最有效的雌激素，其包括雌酮(E1)和雌三醇(E3)。在女性中，主要由卵巢产生雌二醇，由肾上腺次级产生，并在脂肪组织中将甾体前体转化至雌激素。雌二醇负责乳腺和生殖上皮的生长以及第二性征的发育。除了促进健康的骨结构和调节女性胆固醇水平外，雌二醇的正常水平提供适当的排卵、受孕和妊娠。在男性中，睾丸和肾上腺是雌二醇的主要来源。雌二醇被需要用于维持激素平衡和其他腺体的功能。

目前，用于补充雌激素的最主要药物有两类，一类为来源于马尿的雌酮；另一类为化学合成的雌二醇。马尿雌酮是最早应用的雌激素替代物，被全世界广泛应用达数十年之久，几乎成为雌激素的代名词，其制备和纯化的方法已相当成熟。但研究显示，人体真正需要的雌激素为雌二醇，而孕马尿中的雌激素成分主要是雌酮、马烯雌酮、马奈雌酮等；所述雌酮为雌二醇的代谢产物，活性不足雌二醇的十分之一，且有提高心血管疾病的风险、肝损伤、乳腺癌等毒副作用；因此由于雌酮具有高度的副作用，而通常被俗认为是坏雌激素。

制备^[1][5]

报道一、

还原雌酮成为雌二醇：

悬浮2g(7.4mmol)雌酮在10ml水中，加入0.11g(0.37mmol)二甲基二辛 基氯化铵、0.4g(7.4mmol)KBH4，在油浴55℃中机械搅拌3小时。将反应物过 滤，粗品用甲醇重结晶得到β-雌二醇1.84g，收率91％。m.p.178-179℃，氢核 磁共振谱(400MHz，CDCl3)δ：7.95(m，1H，-OH)，7.06(d，J＝8Hz，1H，1-H) 6.53-6.61(m，2H，2-H，4-H)，3.67(m，1H，17-H)，0.73(s，3H，18-H)。

报道二、

采用人骨髓来源细胞使用化合物三甲基胆蒽（MCA）诱导产生并筛选出细胞，并使用该细胞在体外合成性雌二醇；所述细胞已由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC C2012173；

制备步骤为：

（1）人骨髓来源细胞（HMBDCs，主要成分为人骨髓间充质干细胞）采用现有技术（本实施例采用骨髓冲洗、贴壁法）进行原代培养制备，制备的细胞培养于含15%胎牛血清的DMEM培养基，培养条件为37℃，5%CO2，直至105个细胞/培养瓶；

（2）培养基中加入MCA，使其终浓度为1ug/ml，并每星期更换含MCA的培养基2次；MCA处理1周后结束；细胞在37℃，5%CO2环境中，持续常规培养；

（3）培养至3个月，培养物中可见细胞中出现生殖细胞样细胞；上述生殖细胞样细胞表达生殖细胞的标志物：Oct4、Nanos3、c-Kit、DAZL、Vasa；

（4）培养液中检测到雌二醇的持续表达，与未经诱导处理hBMDCs（E2=65±14.8pmol/L， n=6）相比，MCA诱导后hBMDCs中（E2=3243±947 pmol/L， n=6）雌二醇的浓度高达50倍（p<0.01）差异有显著性；重新传代后，观察到随着培养时间的延长，雌二醇浓度进行性增加，传代培养至10天左右达到高峰，高达4500pmol/L，随后逐步下降，最终维持到较高水平；

（5）体内雌二醇是由卵巢中卵泡合成，在体外培养的诱导后hBMDCs中，观察到卵泡样结构的形成（为诱导后hBMDCs中产生雌激素提供细胞支持）；卵母细胞的发育需雌二醇的促进，若缺乏雌二醇，卵母细胞的只能长到25微米；而诱导后hBMDCs中的卵母细胞样细胞体积达到40-50微米；免疫荧光证实上述大细胞为卵母细胞；

（6）卵泡相关基因，包括雌二醇合成的关键性基因：STAR、p450arom、p450c17，以及卵泡发育相关基因GDF9在培养物中表达（进一步支持诱导后hBMDCs具有合成雌二醇的能力）；

（7）优化培养条件，增加雌二醇产生的能力，并降低培养液中血清的浓度（有利于雌二醇的进一步分离纯化）；上述生殖细胞样细胞可进一步增大产生早期卵泡样结构和卵母细胞样细胞；

（8）按现有方法分离、纯化，制得雌二醇。

回收方法^[3]

取30g普罗雌烯有机废渣，投入到500ml高压反应釜中，加入250g甲醇，15g40wt.％稀硫酸和0.3g 10wt.％钯碳(钯的含量为钯碳总质量的10％)，密闭高压反应釜，用氮气置换3次后，升温至35℃，通入氢气，使得压力升高至2.0MPa，保温2小时后，取样检测至反应完毕。

反应完毕后，将钯碳过滤，滤液用饱和碳酸氢钠水溶液调节pH值至4.5，减压蒸馏除去溶剂，加入200g乙酸乙酯和150g纯化水，搅拌30分钟后，静止分层；有机相用150g纯化水洗涤一次，有机相再用5g无水硫酸钠干燥，然后加入0.9g巯基硅胶搅拌1.0小时，过滤，将乙酸乙酯减压蒸馏至干，经过一步精制，得到雌二醇17.9g，以普罗雌烯有机废渣总质量计，雌二醇的产率为60％。

制剂方法^[4]

一种雌二醇透皮喷雾剂，由以下重量百分比的原料组成：

雌二醇        0.1％～10％；

聚合物        0.5％～10％；

促渗剂        0～20％；

增塑剂        0～10％；

溶剂          余量。

为了达到雌二醇透皮喷雾剂持续稳定给药的目的，需要加入能形成薄膜 的聚合物，所述的聚合物优选为甲基丙烯酸酯共聚物、乙烯吡咯烷酮共聚物、 纤维素衍生物中的一种或多种，具体使用时可根据这些聚合物理化性质通过 溶剂调节其在雌二醇透皮喷雾剂中的浓度，以使雌二醇透皮喷雾剂在使用时 的成膜速度和成膜性状良好。