人脂多糖结合蛋白(LBP)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人脂多糖结合蛋白(LBP)ELISA KIT用于测定人血清,血浆及相关液体样本中脂多糖结合蛋白(LBP)含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人脂多糖结合蛋白(LBP)水平。用纯化的人脂多糖结合蛋白(LBP)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入脂多糖结合蛋白(LBP),再与HRP标记的脂多糖结合蛋白(LBP)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的脂多糖结合蛋白(LBP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人脂多糖结合蛋白(LBP)浓度。

人脂多糖结合蛋白(LBP)ELISA KIT

操作步骤：

1、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品*终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

3、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此

重复5次，拍干。

5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

6、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

10分钟.

7、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

8、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于人源化氨基端脂多糖结合蛋白（NH－LBP）基因工程抗体的构建及其生物学活性研究

内毒素血症（endotoxemia）是临床创（烧）伤病人最常见的并发症之一。LPS是G-细菌细胞壁外膜的主要成分,当细菌死亡时LPS释放入血,由肝细胞产生的LBP将其传递给靶细胞膜上的CD14（mCD14）或血液循环中的可溶性CD14（sCD14）,三者形成LPS/LBP/CD14三联复合体,再经过TLR4-MD2-MYD88跨膜受体识别复合物向靶细胞内传递信号,促使胞浆内的NF-κB易位至胞核,导致一系列转录因子的活化,进而释放大量炎性介质和细胞因子,诱发全身炎症反应综合征（SystematicInflammatory Response Syndrome,SIRS）、多器官功能不全综合征（Multiple OrganDysfunction Syndrome,MODS）。

在生理状态下循环血液中只有5—10μg/ml的LBP,在内毒素血症时LBP的浓度可以增高10倍左右,低浓度的LBP可将LPS与CD14的结合放大3-4个数量级。经定点突变以及LBP衍生肽的竞争性抑制研究,提示LBP结合LPS的位点定位于LBP氨基末端部分的第91-100位氨基酸残基。

针对拮抗LBP的研究如动物源性的单克隆抗体,小分子多肽等还处于实验室阶段,研究结果显示动物源性的抗体存在以下局限性:制备工艺复杂,难以大量生产;杂交瘤细胞的稳定性较差;容易产生人抗鼠抗体（HAMA）;难以制备融合蛋白等。全长抗体由于分子量较大,在组织内的渗透性较差,从血液循环中清除速度慢。

近年来随着分子生物学和分子免疫学的迅速发展出现了基因工程抗体,使人们得以对动物源性的单克隆抗体进行改造,构建人鼠嵌合抗体或全人源化抗体,而且抗体的形式也多样化如scFv,dsFv,双功能抗体,Fab’,Fab’2和miniantibody等。基因工程抗体既可从杂交瘤细胞中制备,也可从未经免疫的脾淋巴细胞或人外周血单核细胞中产生。

参考文献

[1]Polymorphism in the exon 4 ofβ-lactoglobulin variant B precursor gene and its association with milk traits and protein structure in Chinese Holstein[J].Fan Yang,Lian Li,Huiling Liu,Yafei Cai,Genlin Wang.Molecular Biology Reports.2012(4)

[2]The Solution Structure of the C-Terminal Ig-like Domain of the BacteriophageλTail Tube Protein[J].Lisa G.Pell,Genevieve M.C.Gasmi-Seabrook,Marc Morais,Philipp Neudecker,Voula Kanelis,Diane Bona,Logan W.Donaldson,Aled M.Edwards,P.Lynne Howell,Alan R.Davidson,Karen L.Maxwell.Journal of Molecular Biology.2010(3)

[3]Lipopolysaccharide-binding protein:Local expression in bovine extrahepatic tissues[J].Md.Mizanur Rahman,Cristina Lecchi,Giancarlo Avallone,Paola Roccabianca,Paola Sartorelli,Fabrizio Ceciliani.Veterinary Immunology and Immunopathology.2010(1)

[4]Lipopolysaccharide-binding protein（LBP）gene polymorphisms:Rapid genotyping by real-time PCR and association with infective endocarditis[J].Tanja Vollmer,Knut Kleesiek,Jens Dreier.Clinical Biochemistry.2009(13)

[5]王长松.人源化氨基端脂多糖结合蛋白（NH－LBP）基因工程抗体的构建及其生物学活性研究[D].第三军医大学,2005.