ATT-20细胞的应用

背景^[1-3]

ATT-20细胞是小鼠垂体瘤通过胰蛋白酶分离的成熟细胞系，AtT-20细胞生长时不贴壁，而结成活细胞团。能抗脊髓灰质炎病毒，检测发现肢骨发育畸形病毒(鼠痘)阴性。生长培养基：Ham's F-12K＋15%HS＋2.5%FBS(164210-500)＋1%P/S，培养条件 气相：空气，95%；CO2，5%温度：37℃。

ATT-20细胞

操作步骤：

1.收到细胞，请查看瓶子是否有破裂，培养基是否漏出，是否浑浊，如有请尽快和我们联系。

2.如包装完好，取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒,拆下封口膜,在显微镜下观察细胞形态是否正常，细胞的贴壁情况以及细胞密度,然后放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置2-3小时，以稳定细胞状态。

3.细胞状态稳定后，弃除培养瓶中大部分液体，只剩5-10ml左右培养液继续培养就可以了，超过80%汇合度时，请按细胞培养条件传代培养。

细胞传代

1)吸出25cm2培养瓶中的培养基,用PBS 2-3ml清洗细胞一次；

2)添加0.25%胰蛋白酶消化液约1.5ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；

3)用吸管轻轻吹打混匀，按1:2等适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5ml，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

4)待细胞完全贴壁后，培养观察。之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

应用^[4][5]

用于格列卫联合依维莫司对小鼠垂体瘤细胞AtT-20的作用研究

探讨格列卫和依维莫司在小鼠垂体瘤细胞AtT-20中联合作用的效果及可能的分子作用机制,为垂体瘤的联合靶向治疗提供参考。

方法1、主要试剂与仪器格列卫和依维莫司为诺华公司惠赠；AtT-20细胞株购于中国科学院上海细胞所,为悬浮培养细胞；胎牛血清购于Gibco公司；RPMI-1640培养液和磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution,PBS）购自美国Hyclone公司；CO2培养箱购自日本三洋公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；酶标仪与PCR仪购于美国Thermo Fisher公司；TRIZOL试剂购于美国Invitrogen公司；PCR用引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成；Real-time PCR试剂盒购自TAKARA公司；一抗AKT与p-AKT、ERK与p-ERK、β-actin单克隆抗体和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的羊抗鼠及羊抗兔二抗购于Cell Signaling公司；The ChemiDoc MP成像仪、电泳槽和转膜仪购于Bio-Rad公司。

2、细胞培养用含100U·mL-1青霉素与100U·mL-1链霉素、10%胎牛血清的RPMI1640培养液,在5%C02、37℃培养箱中培养。每3天离心收集后传代培养,所有实验均采用对数生长期细胞。

3、CCK-8检测细胞增值率及联合指数实验分6组。溶剂对照组；空白对照组；阴性对照组；格列卫处理组（G5、G10、G15、G20、G25μM）;依维莫司处理组（E0.1、E1、E10、E100、E200nM）;联合用药组（E1+G15、E10+G15、E10+G20）;取对数生长期的细胞按1×105个/孔接种于96孔细胞培养板中,不同浓度的依维莫司和格列卫按分组设计依次加入,单独用药处理24、48、72h,联合用药处理72h。每孔加入10%CCK-8于37℃培养4h后置酶联免疫检测仪上测定各孔在波长490nm处的吸光度（A）值。每组设平行孔3个,实验重复进行3次。

计算细胞增殖率：细胞增殖率（%）=（实验孔吸光度-空白孔吸光度）/（阴性对照组吸光度-空白孔吸光度）×100%。计算联合指数（Combination Index,CI）使用Chou-Talalay公式：CI=CA,X/ICX,A+CB,X/ICX,B（CA,X,CB,X分别是联合用药达到X%的药效时,药物A和药物B的浓度；ICX,A’ICX,B分别是单独用药达到相同的药效时,药物A和药物B的浓度）,CI等于1表明两药之间以相加的方式相互作用,CI小于1表明两药之间以协同的方式相互作用,CI大于1表明两药之间以拮抗的方式相互作用。

参考文献

[1]PDGF receptor signaling networks in normal and cancer cells[J].Jean-Baptiste Demoulin,Ahmed Essaghir.Cytokine and Growth Factor Reviews.2014

[2]Detection of H 2 O 2-Mediated Phosphorylation of Kinase-Inactive PDGFRα[J].Hetian Lei,Andrius Kazlauskas.Methods in Enzymology.2013

[3]mTOR is Frequently Active in GH-Secreting Pituitary Adenomas without Influencing their Morphopathological Features[J].Emir Ahmed Sajjad,Grzegorz Zieliński,Maria Maksymowicz,?ukasz Hutnik,Tomasz Bednarczuk,Pawe?W?odarski.Endocrine Pathology.2013(1)

[4]Extended endoscopic endonasal skull base surgery:from the sella to the anterior and posterior cranial fossa[J].AmandaOostra,Woutervan Furth,ChristosGeorgalas.ANZ Journal of Surgery.2012(3)

[5]李浩.格列卫联合依维莫司对小鼠垂体瘤细胞AtT-20的作用研究[D].南方医科大学,2016.