秋水仙素的应用

背景及概述^[1][2]

秋水仙素是从百合科植物秋水仙的鳞茎和种子中提炼出来的一种植物碱。一般商品为淡黄色粉末，味苦，融点155℃，易溶于冷水、酒精、氯仿和甲醛，在热水中溶解度较差，不易溶于苯和乙醚。1889年佩尔尼切首先发现了秋水仙素对有丝分裂产生的影响，他描述 了狗肠胃内壁细胞的分裂中期被秋水仙素所阻抑，纺锤体被破坏，染色体行动瘫痪，不正常的有丝分裂细胞大量停留在中期。这种由秋水仙素引起的不正常的分裂称秋水仙素有丝分裂(简称C有丝分裂)。在核型分析和多倍体的诱变中，

秋水仙素是一种应用最广泛的化学药剂。其水溶液的浓度和它的作用效力成正相关，浓度越高，作用越强。各种植物和不同组织对秋水仙素有不同的反应。概括地说，对幼嫩而分裂 迅速的组织(如萌动种子的胚芽)处理时间可较短，浓度应低些;反之处理时间可长些，浓度应高些。秋水仙素处理的有效浓度为0.01～0.4%，而以0.2%左右的应用范围最广。如将浓度为 0.2～0.4%的秋水仙素溶液滴在二倍体西瓜幼苗生长点上，每日一次，连续4天，并遮阴保持湿度，即可诱导四倍体西瓜。对于谷类作物，如水稻，则可将有四片以上真叶的健壮秧苗在根颈处割一切口，以不割伤生长点为度，浸入0.025～0.05%的秋水仙素溶液中，淹没切口，经 8～14天(20℃)也可得四倍体植株。目前秋水仙素广泛用于花药(粉)、子房培养的所得单倍体植株的染色体加倍。秋水仙素毒性很大，能引起眼睛的暂时失明，导致中枢神经系统麻痹并引起呼吸困难，使用应注意安全。

应用 ^[2-3]

一、用秋水仙素诱导玉米孤雌生殖

选育玉米自交系的常规方法，育成一个自交系至少需要经过7代以上的连续自交，对于遗传背景复杂的材料甚至要10代以上。为了加快自交系的选育速度，缩短育种周期和提高纯度，国内外通常采用的方法主要有：秋水仙素诱导法。

在玉米吐丝期，用秋水仙素作为染色体加倍处理剂处理花丝，使其不经过双受精而是通过孤雌生殖直接产生纯合的二倍体种子。秋水仙素是常用的染色体加倍处理剂，其突出优点是诱导率高，因此在教学和科研中被广泛使用。然而，尽管秋水仙素诱导玉米孤雌生殖已是一种成熟的玉米自交系选育技术。但是该方法存在的两大问题，使其难以在育种上规模化应用：一是安全问题。秋水仙素属于剧毒试剂，致癌性强。为了尽量避免与人体接触，现有技术均采取涂抹花丝或向花丝注射的方法。但涂抹时极易造成刮碰和药液滴落，注射时由于花丝间的空隙很小，用量难以掌握，极易造成药液溢出和流淌。因此，对人体健康威胁很大。二是花粉污染问题。处理时，即使在严格的套袋条件下操作，或遮挡，或避开散粉时间，但花粉污染问题仍很严重，产生大量假种子，特别是在海南气候条件下。此外，由于花丝生长紧密，注射时对药液的容纳量很少，一部分花丝不容易接触到药液；又由于花丝亲水性差，涂抹时不容易附着，难以达到理想的处理效果；为了保证安全，操作要求极其严格。因此，处理动作谨慎，速度慢、效率低，也是造成不能规模化应用的原因。

CN201410405142.6采用的技术方案如下：

1.诱导剂配制

配制常规的秋水仙素(COL)诱导剂，或以秋水仙素为主与二甲基亚砜(DMSO)、 青鲜素(MH)复配而成的诱导剂。

2.诱导前果穗处理

在吐丝前对雌穗套袋；待花丝完全吐出时摘掉纸袋，在雌穗花苞由顶部向下接近雌穗幼穗的位置横向切掉部分花苞。呈现中间是花丝，周围是苞叶的圆形断面；用弧形刻刀在断面上切掉一截花丝，切割的深度为8—15mm，做到既切掉花丝又不切漏周围的苞叶，即在断面上形成深度为8—15mm的空洞。

3.注入诱导剂

为防止药剂与人体接触，将诱导剂装入封闭严密的器具如移液枪或注射器。之后向空洞内注入诱导剂，充满且药液覆盖或润湿整个断面为止。最后将纸袋套回，完成处理过程。

由于花粉遇到处理液后会因吸收药液而膨胀死亡，断面上即使有花粉落入也不会造成任何污染。因此，彻底解决了花粉污染问题，确保种子真实可靠。处理时，不需要密封、遮挡或隔离，整个过程在完全开放条件下自由操作。

4.收获与繁殖

种子成熟时收获，即得到基因型纯合的二倍体种子；下一季播种，套袋自交，根据表型进行真伪和优劣鉴定，选择优良植株，得到单穗。并可以其作父本在此代提前测配；将收获的果穗继续播种下一代，种成穗行,根据植株、果穗、籽粒等性状的一致性鉴别出纯合穗行，选择符合育种目标的穗行收获，即获得纯合的玉米自交系。可在此代进行大量测配。

本方法的积极效果如下：

1.解决了使用秋水仙素的安全问题

采用横断面挖洞施药，避免了现有技术由于涂抹时导致的刮碰和药液滴落，注射时的药液溢出、流淌等对人体健康造成的威胁。

2.解决了现有技术的花粉污染问题

由于处理液淹没了全部花丝的顶部及覆盖整个切面，即使有花粉飘落也会由于花粉遇到处理液后吸水而膨胀死亡，彻底解决了现有技术中难以解决的花粉污染问题。

3.可在完全开放条件下自由操作

诱导处理时不需要在套袋、遮挡、空间隔离区或时间隔离条件，可以在完全开放 条件下和在任何时间里自由操作。

4.适合规模化应用

由于使用安全、程序简便、操作简单容易，并且不受隔离区限制，因此可规模化应用。

5.诱导率提高

既利用了秋水仙素诱导率高的优势，又保证所有花丝都能与药液接触，还使药液停留时间延长，因而诱导率提高。

6.节省药液

药液集中，且不流淌浪费。现有的秋水仙处理技术一般每穗需药液2ml左右，而此方法仅需1ml左右，可节省药液50％左右，降低了用药成本。

7.程序简单

直接形成二倍体种子。与Stock 6诱导单倍体技术相比，一是不需要染色体加倍过程；二是不需要当代种子鉴别；三是不存在种子鉴别困难等问题。

8.选育速度快

比常规玉米自交系选育方法的选育周期缩短5代以上。由于可确保诱导结籽的真实性以及诱导代植株能正常散粉，因此从诱导代开始就可以其作父本进行提前测配，杂交种选育速度比Stock 6诱导单倍体技术还要提前1代。

二、培育同源四倍体七叶一枝花植株

用于培育一种同源四倍体七叶一枝花植株。通过此方法可快速实现同源四倍体七叶一枝花植株的培育，进而有效提高其活性成分的含量，克服七叶一枝花在自然繁殖和人工种植中出现的品种退化问题。步骤如下：

(1)繁育组培苗：取性状优良的七叶一枝花植株的叶芽，通过植物组织培养技术，繁育 出组培苗(该步所涉及的技术为常规技术)；

(2)秋水仙素处理：用以下两种方法之一处理：

①在无菌条件下，选取生长势强的组培继代苗，在茎部造成若干(2～5个)创伤(所述创伤是指用器械轻轻划伤)，然后用脱脂棉包裹严密，再在脱脂棉上滴入质量浓度为0.03％～ 0.05％的秋水仙素溶液浸润，在分化培养基上培养10～15天后，用无菌水洗净，切成单芽后 转接到丛生芽诱导培养基中；

②将组培苗转接至添加质量浓度为0.05％～1.0％的秋水仙素的分化培养基中，培养20～30天后，切成单芽转接至丛生芽诱导培养基中；

所述分化培养基的组份组成为：MS+BA 0.5～0.8mg/L+GA3 0.1～0.5mg/L+NAA 0.1～0.3mg/L+CTK(细胞分裂素)0.3～0.5mg/L(即：向MS培养基中加入终浓度为0.5～0.8mg/L的BA、0.1～0.5mg/L的GA3、0.1～0.3mg/L的NAA以及0.3～0.5mg/L的CTK而成；该表 述方式为所属领域技术人员惯用的表述方式；下同；所述MS培养基为现有技术中常用的培养基)；

所述在分化培养基中培养的培养条件为：温度25～30℃，每天日照8～12h，光照强度 60μmol·m^-2·s^-1；所述丛生芽诱导培养基的组分组成为：MS+BA 1.5～2.0mg/L+GA3 0.1～0.5mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L+蔗糖20～30g/L；

(3)诱导植株分化培养：在丛生芽诱导培养基中培养25～35天，诱导产生丛生芽，培养条件为：温度20～30℃，每天日照8～12h，光照强度120μmol·m^-2·s^-1；

(4)诱导植株增殖培养：将上述长出的丛生芽转接入增殖培养基中，在温度20～30℃，每天日照8～12h，光照强度120μmol·m^-2·s^-1的条件下，培养25～35天，将丛生芽分株培养成完整植株；所述增殖培养基的组分组成为：MS+BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0.2～0.5mg/L+蔗糖20～30g/L；

(5)诱导植株染色体检测：切取步骤(4)中得到的完整植株，在解剖镜下剥离茎尖， 经过压片染色，在显微镜下进行染色体数目检测；

(6)选育同源四倍体植株：通过染色体数目检测，筛选出四倍体植株，转接至生根培养基中，在温度25～30℃，每天日照8～12h，光照强度120μmol·m^-2·s^-1的条件下，培养25～35天，即培育出同源四倍体完整植株；

主要参考资料

[1] 科学技术社会辞典·生物

[2]CN201410405142.6 一种用秋水仙素诱导玉米孤雌生殖的处理方法

[3]CN201410445856.X 同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法