水蛭素的制备

背景及概述^[1][2]

水蛭 (Leech)，俗称蚂蟥，属环节动物门蛭纲，体型呈扁平纺锤形。水蛭人药在我国最早记载 于 2000 多年前东汉时期的药物学 专著《神农本草经》，我国中医认为水蛭具有破血逐淤通经的功效，主要于治疗血瘀经闭、瘢瘕痞块、跌打损伤。水蛭素 (H irudin) 是水蛭 的活性成分。1884 年，英国威尔士国家医学院的海克拉夫特(H aycraf t) 博士首先发现医蛭咽部具有抗 热的水溶性抗凝血物质。1904 年，英国科学家雅各比(Jacoby) 成功地把这种抗凝 血有效成分分离出来，并命名为“水蛭素”。

蛭是活血化瘀类动物药材的代表药，应用于临床已有悠久历史，可明显改善血瘀成功提取并广泛应用于临床，量效关系明确，与肝素、阿司匹林等传统的抗凝药物相比，水蛭素用量小，疗效高，不良反应少而轻，重组水蛭素已成为一种新型的抗凝、防栓药物。然而，由于临床应用重组水蛭素还存在一定的风险，如产生免疫原性及出血危险等；而且，作为抗凝血酶药物，重组水蛭素预防动脉血栓的效果并不理想。对其进行分子修饰，以期延长半衰期、降低出血风险已成为研究的热点。

结构

天然水蛭素是一条含 65 或 66 个氨 基酸残基组成的单链多肽，分子质量为 7 kD，其 N 末端有 3 对二硫键(Cys6-Cysl4，Cysl6-Cys28，Cys32 -Cys39 )，使肽链绕叠成密集形核心环肽结构，对蛋白结构起稳定作用。其 N 末端含活性中心，能识别底物-凝血酶碱性氨基酸富集位点，并与之结合。

C末端富含酸性氨基酸残基，最后 9 个氨基酸 中有 6 个为酸性氨基酸。天然水蛭素第 63 位的酪氨酸残基被硫酸化，而重组水蛭素没有这个特殊的结构，因此后者抗凝 比活性有所下降。水蛭素肽链中部有一个由Pro-Lys -Pm 组成的特殊序列，不被一般蛋白酶降解，这有助于维持水蛭素分子的稳定性。

应用^[1]

1. 心脑血管疾病

随着介入心脏病学突飞猛进的发展，药物洗脱支架(drug —eluting stent，D ES ) 的出现使冠心病支架置入术后支架内再狭窄的发生率降低至 10％，然而涂层药物降低支架再狭窄率的同时，也影响到内皮细胞的愈合而导致血管内皮化延迟，进而激活血小板、活化凝血酶，增加晚期致命性支架内血栓形成的风险。

任晓霞等 通过观察水蛭素对体外培养的兔血管内皮细胞及平滑肌细胞生长的影响，认为中等浓度水蛭素与现有药物支架涂层药物复合使用既可以预防支架内再狭窄，又可以通过抑制凝血酶作用而发挥预防晚期支架 内血栓 的风险

2. 急性弥漫性血管内凝血(DIC )

用 48 只家兔 D IC 模型进行重组水蛭素抗 D IC 的研究，结果表明，重组水蛭素有强抗 DIC 作用，并呈明显剂量依赖关系，其抗 D IC 的有效剂量低，作用强度为肝素的 2 倍以上。24 例男性健康志愿者静脉注射脂多糖(LPS )2 m g/kg，诱发 DIC，随后分为实验组与对照组进行，治疗结果显示，对照组凝血酶一抗凝血酶Ⅲ复合物(TAT ) 和D-D二聚体明显高于实验组，提示水蛭素有治疗 DIC 功效 。

3. 皮肤瘢痕

通过观察水蛭素对皮肤增生性瘢痕成纤维细胞 bF-GF 及 TGFp 表达的影响，表明水蛭素可下调TG m RNA 和蛋白水平表达，同时上调 bFGF 的 mRNA 和蛋白水平表达，作用呈剂量依赖性，水蛭素对瘢痕有治疗效果。通过观察不同浓度水蛭素对体外培养 H SFb 的影响，表明水蛭素对H SFb 的增殖有抑制作用，水蛭素能增加 Bax 表达，抑制 Bcl-2表达，实验浓度水蛭素对 HSFb 有显著的抑制作用。

4. 肾脏疾病

重组水蛭素能够减少 肾小球内纤维蛋白相关抗原沉积，减轻肾小球系膜细胞增殖和肾小球硬化，减轻蛋白尿和低蛋白血症，改善肾功能。研究证实，转化生长因子-B(TGF -B1) 表达增加与细胞外基质(ECM )沉积增加相一致，TGF -pB1是肾小球硬化的主要介质。水蛭素可显著抑制 OX-LD L 诱导活化巨噬细胞导致的系膜细胞 TGF-B 和 FNm RN A 表达上调，提示水蛭素可能通过抑制系膜细胞TG F B 和FN 的过度表达而抑制肾硬化的发生。

剂型研究^[1]

目前的新药研究领域，开发一个全新的药物十分困难，研究热点大都集中在对现有药物的分子改造或是结构修饰上，同时设法降低毒副作用。针对在临床应用中所出现的问题，将重组水蛭素类多肽药物进行各种类型的结构修饰，以期降低良反应。

目前水蛭素的类似物包括 RGD-重组双功能水蛭素、多功能融合水蛭素、聚乙二醇修饰水蛭素。现用于临床的水蛭素注射剂还存在一系列问题：半衰期较短，对纯度要求较高，易经肾排泄，经常注射给患者带来不便。人们正在研究一些非注射给药途径，包括肺部、气管、鼻腔、口腔黏膜、直肠以及口服给药 。

制备 ^[4]

     方法1：从菲牛蛭活体中提取天然水蛭素的方法。

该发明是将清洗干净的菲牛蛭用诱导物质充分喂饱菲牛蛭，然后对菲牛蛭进行挤压使其分泌出唾液（水蛭素粗品），所采用的诱导物质包括无机盐、有机酸和浓度较低的无机酸。具体方法是先配置好纯净的混合水溶液，让菲牛蛭充分吃饱，然后对其进行挤压，使其分泌出唾液，每隔一周或10天提取一次，每条鲜活菲牛蛭可以反复提取6-7次，每次能提取水蛭素粗品6-7毫升左右。

方法2：从天然水蛭中提取高抗凝活性水蛭素的方法。

该发明是将氯化钠、一水乙酰半胱氨酸盐酸盐、赖氨酸、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的两种或多种物质进行组合，溶解于去离子水中配制成刺激液。将活体水蛭称重后置于容器中，按水蛭重量比刺激液体积为1∶1～5倍加入所述刺激液，刺激3小时使水蛭分泌分泌液，分泌液经过16000～20000r/min离心分离得水蛭素粗品，经0.2微米不锈钢膜微滤，再经10000～3000道尔顿分子量的有机膜超滤，再进行反渗透纳滤浓缩，然后按固体比液体的重量体积比为1：6～10加入药用淀粉调配，经喷雾干燥，得水蛭素成品。

主要参考资料

[1] 张和韡, 王丽萍. 水蛭素的研究进展[J]. 中国中西医结合肾病杂志, 2013, 14(1): 76-78.

[2] 胡哲, 张静. 水蛭素的应用研究进展[J]. 包头医学院学报, 2014, 30(3): 152-154.

[3] 黄胜, 熊伟, 姚俊杰, 等. 水蛭素提取纯化研究进展[J]. 中国生化药物杂志, 2017, 37(02): 313-315.

[4] 周维官;刘晶;吴玉琴. 一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法. CN201210493449.7，申请日20121128